羅 淵 索塔林 李 燕 葛淑靜 周洪哲 唐 捷 段連寧

(中國人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學實驗室，北京100142)

白血病的根本治愈手段主要是造血干細胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，然而白血病復(fù)發(fā)仍是臨床面臨的最大難題。雖然針對白血病的生物免疫療法如供者淋巴細胞輸注(DLI)或者供者自然殺傷細胞輸注(DNKI)可以解決部分移植后復(fù)發(fā)問題［1］，但是，白血病患者復(fù)發(fā)后對免疫治療的敏感性仍然非常低下，嚴重限制免疫治療的開展。

有學者發(fā)現(xiàn)，當供者的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)與受者的KIRs配體不相合時，可以誘發(fā)NK細胞的同種異體反應(yīng)活性［2］。清除T細胞后的移植物中含有的有同種異體反應(yīng)活性的NK細胞可增強移植物抗白血病(GVL)的效應(yīng)，并且極大地降低移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生［3］。NK細胞表面表達一系列的受體，可分為激活性受體和抑制性受體兩大類，其對靶細胞的殺傷與否取決于兩類受體與相應(yīng)配體結(jié)合后的信號整合［4-6］。本研究以一種成功建系的NK細胞——NK-92細胞為效應(yīng)細胞，通過研究7種白血病細胞系的10種NK配體表達情況及其被NK-92細胞殺傷情況，分析白血病細胞NK配體表達與NK敏感性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 細胞系 人NK-92細胞株，人急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞株CEM、Reh和LCL，以及人急性髓系白血病(AML)細胞株 U937、KG-1a、HL-60和NB4均為合作單位中國科學院生物物理研究所常規(guī)保存。NK-92細胞的全培養(yǎng)基為含2 mmol/L L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氫鈉、0.2 mmol/L肌醇、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇、0.02 mmol/L葉酸、100～200 U/ml重組IL-2、12．5%胎牛血清和12．5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)液。白血病細胞系的全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。依據(jù)細胞濃度，每2～3天換液或傳代。

1．2 主要試劑與儀器 RPMI1640細胞培養(yǎng)液、α-MEM細胞培養(yǎng)液、特級胎牛血清(Gibco)，Trizol(Invitrogen公司)，引物合成(上海生工)，DNA聚合酶、DNA Marker(TaKaRa公司)，熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)和碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，核酸電泳儀(Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1．3 流式細胞術(shù)檢測NK-92細胞殺傷實驗 收集白血病細胞系，用無血清1640洗滌兩次，細胞計數(shù)后用37℃培養(yǎng)基重懸濃度至 5×107個細胞/ml。接著加入CFSE，使其終濃度為2 μmol/L，在37℃孵育15分鐘，注意避光、不時混勻，進行靶細胞染色。加入5倍體積、冰預(yù)冷的1640完全培養(yǎng)基以終止反應(yīng)。同時，將效應(yīng)細胞NK-92用無血清α-MEM細胞培養(yǎng)液洗滌一遍，對效靶細胞分別計數(shù)，將效靶比(E∶T)設(shè)為4∶1，混合后于37℃孵育3小時。收集細胞，加入PI進行死亡細胞染色。同時設(shè)置單獨效應(yīng)細胞、單獨靶細胞和0小時混合細胞作為對照，用流式細胞儀進行檢測。CFSE陽性的為染色的靶細胞，而CFSE和PI雙陽性則為被NK-92殺傷的靶細胞，靶細胞殺傷率=(實驗組CFSE和PI雙陽性細胞數(shù)/實驗組CFSE陽性細胞數(shù)－對照組CFSE和PI雙陽性細胞數(shù)/對照組CFSE陽性細胞數(shù))×100%。

1．4 NK配體表達的半定量RT-PCR檢測 常規(guī)培養(yǎng)以上7種白血病細胞系，至合適密度時收集細胞，按Trizol試劑盒說明書操作提取細胞總RNA，分裝后凍存于－80℃。用Oligo(dT)做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，特異性地把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著用設(shè)計的引物分別擴增目的基因和內(nèi)參基因，引物序列和擴增目的條帶大小如表1所示。PCR過程為:94℃變性5分鐘后，94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒順序循環(huán)30次，最后72℃延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、拍照后，用Gel Pro 4．0軟件分析各條帶光密度值，目的基因表達值=目的條帶光密度值/β-actin光密度值。

1．5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17．0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示。白血病細胞系NK-92殺傷率或NK配體表達水平的組間比較采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗，P＜0．05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2．1 采用流式細胞術(shù)的方法檢測NK-92細胞對白血病細胞的殺傷效應(yīng)，結(jié)果見圖1、表2。結(jié)果可見，NK-92細胞對以上細胞系的殺傷作用分別為(21．00±1．17)%、(21．93 ± 3．00)%、(10．87 ± 0．52)%、(5．58±0．78)%、(4．89 ± 0．61)%、(0．69 ±0．41)%、(0．67 ±0．40)%。根據(jù) NK-92 細胞對靶細胞的殺傷效應(yīng)強弱，將以上7種白血病細胞系分成NK敏感組(U937、CEM、KG-1a)、NK中度敏感組(HL-60、NB4)和不敏感組(Reh、LCL)，組間比較的P=0．003，差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 NK配體和內(nèi)參基因的擴增引物Tab．1 Primers for the detection of NK ligands and control gene

圖1 流式細胞術(shù)檢測NK-92細胞對白血病細胞系的殺傷效應(yīng)Fig．1 The sensitivity of leukemia cell lines to NK-92 detected by FCM

表2 白血病細胞NK配體表達水平及其NK-92敏感性Tab．2 Relative expression of NK ligands on leukemia cells and their sensitivity to NK-92

2．2 采用半定量RT-PCR的方法檢測白血病細胞系的NK配體。由于電泳圖片較多，在此只列出已換算成光密度比值的結(jié)果，見表2。結(jié)果表明，PVR(CD155)和HLA-F在組間的差異具有統(tǒng)計學意義，NK-92不敏感組的PVR轉(zhuǎn)錄水平最低而HLA-F的最高，其他配體間則無顯著性差別。

3 討論

NK-92細胞是Klingemann實驗室于1992年從一名惡性非霍奇金淋巴瘤患者外周血分離并成功建系的大顆粒淋巴細胞［7］。NK-92與普通NK細胞一樣，識別靶細胞無MHC限制性，可以在無預(yù)先致敏的情況下殺傷腫瘤細胞。而且，NK-92細胞幾乎不表達常見的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)，如2DS1-5、2DL1-3、3DL1-2 和 3DS1 等，而只表達唯一的2DL4［8］。該受體胞漿區(qū)含有一個免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)，但是跨膜區(qū)含有一個帶正電的精氨酸殘基，也有可能結(jié)合伴隨分子而傳遞激活性信號，因此2DL4同時具有抑制性受體和激活性受體的特征。正因為NK-92細胞不表達大部分KIRs，所以不能識別HLA-A、B、C等經(jīng)典的MHCⅠ類分子，從而類似于“丟失自我”(Missing self);同時，NK-92細胞表達一系列與殺傷功能密切相關(guān)的NK激活性受體、協(xié)同活化受體和凋亡誘導(dǎo)受體等，如NKG2D、NKp30、NKp46、LFA、2B4、DNAM-1、FasL、TRAIL 等，而抑制性受體的表達較少，僅見ILT-2、NKG2A/B，因此，NK-92細胞具有很高的殺細胞活性和很廣的靶細胞譜［8，9］。

本研究分別檢測了7種白血病細胞系的10種NK配體，其與NK受體的對應(yīng)關(guān)系見表3。從結(jié)果可見，NK敏感組、中度敏感組和不敏感組的激活性配體PVR和抑制性配體HLA-F的轉(zhuǎn)錄水平有顯著性差異，而其它配體組間均沒有顯著性差異。其中，NK不敏感組的PVR水平(激活性配體)明顯低于其他兩組，HLA-F水平(抑制性配體)明顯高于其他兩組，而NK敏感組與中度敏感組間的差異不顯著。初步表明，PVR和HLA-F這兩個配體在白血病細胞系對NK細胞殺傷的耐受機制中發(fā)揮了重要作用，而其他八種配體的轉(zhuǎn)錄水平則有高有低，沒有明顯的規(guī)律性。

表3 NK受體與配體的對應(yīng)關(guān)系Tab．3 The corresponding relationship between NK receptors and ligands

NK細胞屬于固有免疫系統(tǒng)，是機體抵抗腫瘤和感染的第一道防線。在血液系統(tǒng)腫瘤的免疫監(jiān)視中發(fā)揮主要作用的NK細胞殺傷活性相關(guān)受體主要包括自然細胞毒受體(NCRs)、自然殺傷組2成員D(NKG2D)和 DNAM-1［10］。因此，為了逃逸 NK 細胞的免疫監(jiān)視，白血病細胞進化出了若干的手段，如下調(diào)表達激活性配體、激活性配體從細胞膜脫落成游離態(tài)、高表達抑制性配體等［9］。本研究的結(jié)果顯示，NK耐受組細胞采用的逃逸策略是低表達DNAM-1的配體PVR的同時高表達抑制性受體LIR2的配體HLA-F。Pende等學者發(fā)現(xiàn)，髓源性白血病常持續(xù)表達DNAM-1的配體(PVR、Nectin2)，而淋巴系白血病的表達更少［11］。本研究中低表達PVR的兩種細胞系均是淋巴系來源，而Nectin2的表達差別則不顯著。HLA-F分子是非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，通常表達于細胞漿內(nèi)，接受一定的信號后則表達在細胞膜上，被認為是淋巴細胞活化的表面標志［12］。本研究表明，腫瘤細胞提高表達 HLA-F可能也是一種重要的逃逸機制。

國外有學者認為，B系急性淋巴細胞白血病細胞對NK細胞耐受的機制主要為缺乏足夠的激活性信號，而與抑制機制無關(guān)［13］。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)一個有趣的結(jié)果，NK不敏感組細胞在降低激活性信號的同時，也提高抑制性信號，從而大大增強了其對NK細胞的抵抗能力。通過本研究，我們初步找出了人為干預(yù)腫瘤細胞耐受NK細胞的兩個靶點分子(PVR和HLA-F)，為后續(xù)的工作打下了基礎(chǔ)。但是，本研究也存在一定的局限性，如本研究采用的半定量PCR法準確性不高，在后續(xù)工作中應(yīng)用實時定量PCR和流式細胞術(shù)進行驗證。而且本研究的NK配體數(shù)量有限，若能進行大規(guī)模、全面的配體檢測，將會得出更有意義的數(shù)據(jù)。腫瘤的NK細胞免疫治療是一個很有前景的發(fā)展方向［14］，只有在充分了解NK細胞活化機制的基礎(chǔ)上，才能針對不同腫瘤進行不同的人為干預(yù)，使生物治療的療效最大化，更好地服務(wù)于人類的健康事業(yè)。

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