劉 曉 付 蓉 王 珺 王化泉 劉春燕 阮二寶 瞿 文 梁 勇 王國(guó)錦 王曉明 劉 鴻 吳玉紅宋 嘉 邢莉民 關(guān) 晶 李麗娟 邵宗鴻 (天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液腫瘤科，天津300052)

獲得性重型再生障礙性貧血(SAA)是一組以貧血、感染、出血為臨床表現(xiàn)的重度骨髓衰竭性疾病，其發(fā)病與CD8+T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)導(dǎo)致骨髓造血細(xì)胞過度凋亡有關(guān)［1］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，SAA患者Ⅰ型淋巴因子白細(xì)胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ水平增高，CD8+T細(xì)胞比例增加、功能亢進(jìn)，胞漿內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)增加，血漿中TNF水平增高，且SAA患者外周血活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)亞群之一CD8+HLA-DR+T細(xì)胞比例明顯增高，在SAA的免疫發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［2］。本研究擬體外混合培養(yǎng)SAA患者CD8+HLA-DR+T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)與正常人去除CD3+T細(xì)胞后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)(靶細(xì)胞)，并于培養(yǎng)體系中加入不同濃度TNF-β，通過檢測(cè)靶細(xì)胞凋亡程度說明TNF-β對(duì)CD8+HLA-DR+T細(xì)胞損傷骨髓造血細(xì)胞的影響;同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10水平，觀察TNF-β對(duì)CD8+HLA-DR+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 病例為我科2011年2月至2011年7月收治的初診SAA患者15例，男8例，女7例，中位年齡23(6～46)歲，診斷符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中SAA的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。正常對(duì)照15名，均為正常健康人，男9名，女6名，中位年齡26(24～32)歲。研究方案已通過天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。

1．2 主要試劑與儀器 鼠抗人CD8、鼠抗人HLADR、鼠抗人CD3單克隆抗體及磁珠分選儀均為德國(guó)Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品;鼠抗人PE-CD8、鼠抗人FITC-HLA-DR、鼠抗人 PE-IgG1、鼠抗人 FITC-IgG1單克隆抗體均為美國(guó)BD PharMingen公司產(chǎn)品;FITC標(biāo)記的細(xì)胞膜聯(lián)蛋白(Annexin V＆PI)細(xì)胞早期凋亡檢測(cè)試劑盒為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;IFN-γ、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒為美國(guó)RB公司上海分裝產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司的BD FACSAria。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 細(xì)胞分選 用含肝素的試管取患者及正常成人骨髓10 ml，PBS 2倍稀釋，以淋巴細(xì)胞分離液(比重1．077)密度梯度法分離BMMNC。

計(jì)數(shù)細(xì)胞，患者BMMNC約每1×107個(gè)細(xì)胞中加人20 μl CD8磁珠抗體，4℃孵育15分鐘后，洗滌2次，磁性條件下過柱，脫離磁場(chǎng)，充分沖洗柱子，收集細(xì)胞。每1×107個(gè)細(xì)胞加入20 μl CD8解離抗體進(jìn)行解離，5 μl終止抗體終止解離后，加入 20 μl HLA-DR抗體，4℃孵育15分鐘，洗滌2次，磁性條件下過柱后，脫離磁場(chǎng)，充分沖洗柱子，收集細(xì)胞。正常成人BMMNC約每1×107個(gè)細(xì)胞中加人20 μl CD3磁珠抗體，4℃孵育15分鐘后，洗滌2次，磁性條件下過柱，收集陰性細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選細(xì)胞純度。實(shí)驗(yàn)管加入上述分選所得細(xì)胞1×105、鼠抗人FITC-HLA-DR、PECD8各10 μl。對(duì)照管加入上述分選所得細(xì)胞1×105及相應(yīng)同型對(duì)照各10 μl。4℃避光孵育20分鐘，PBS洗滌2次，上機(jī)。

1．3．2 細(xì)胞培養(yǎng) 將上述分選所得 SAA患者CD8+HLA-DR+T細(xì)胞(效應(yīng)T細(xì)胞)和正常人去除CD3+細(xì)胞的BMMNC(靶細(xì)胞)平均分成4份，以5×105ml－1細(xì)胞濃度置于24孔板中(CD8+HLADR+T細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為1∶1)，實(shí)驗(yàn)組中加入TNF-β，使其終濃度分別為 15、25、50 ng/ml，每孔中加入12%滅活的小牛血清，用完全RPMI1640調(diào)整細(xì)胞懸液至每孔2 ml，置于37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)72小時(shí)。

1．3．3 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子檢測(cè) 應(yīng)用Annexin V＆PI雙標(biāo)法標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。應(yīng)用ELISA試劑盒分別檢測(cè)培養(yǎng)體系上清中IFN-γ、IL-10表達(dá)水平。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)符合正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料，用x±s表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選細(xì)胞 SAA患者效應(yīng)細(xì)胞CD8+HLA-DR+細(xì)胞純度均在90%以上，正常對(duì)照測(cè)定CD3－靶細(xì)胞比例在90%以上(圖1)。

2．2 Annexin V＆PI檢測(cè)靶細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀Annexin V＆PI雙染法檢測(cè)靶細(xì)胞的凋亡情況(見圖2)。左下象限(An－，PI－)代表正?；罴?xì)胞;右下象限(An+，PI－)代表早期凋亡細(xì)胞;右上象限(An+，PI+)代表壞死細(xì)胞和晚期細(xì)胞凋亡;左上象限(An－，PI+)代表收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞。從表1可見，15 ng/ml組凋亡率與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);25 ng/ml組凋亡率高于空白組和15 ng/ml組(P均小于0．05);50 ng/ml組凋亡率顯著高于空白組(P＜0．01)和15 ng/ml(P ＜0．05);但是 50 ng/ml組與 25 ng/ml組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選細(xì)胞Fig．1 Purity of cells by MACS

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Fig．2 Apoptotic rate measured by flow cytometry

表1 各組培養(yǎng)體系靶細(xì)胞凋亡率Tab．1 Apoptotic rate(AR)of each group

表2 培養(yǎng)體系上清中IFN-γ、IL-10濃度Tab．2 The levels of IFN-γ and IL-10 in culture supernatant of each group

2．3 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)體系上清中IL-10、IFN-γ水平 IL-10水平各組間無(wú)顯著差異(P＞0．05);50 ng/ml組上清中IFN-γ水平高于空白組(P＜0．05)，而15 ng/ml組和25 ng/ml組與空白組比較無(wú)差異(P ＞0．05)，如表2。

3 討論

SAA是以骨髓造血功能衰竭和高病死率為特征的血液系統(tǒng)重癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)SAA患者的髓樣樹突細(xì)胞(mDC，DC1)數(shù)量增多，Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞比例增高、CD4+IFN-γ+細(xì)胞、CD4+IL-2+細(xì)胞比例增高，具有保護(hù)作用的NK細(xì)胞比例下降、造血負(fù)調(diào)控因子IFN-γ、IL-2等分泌增高、CTL比例增高，抗T細(xì)胞球蛋白(ATG/ALG)聯(lián)合環(huán)孢菌素(CsA)的強(qiáng)化免疫抑制治療(IST)可使近70%的患者達(dá)到完全緩解，進(jìn)一步證實(shí)了SAA患者存在免疫激活及免疫耐受機(jī)制的異常，導(dǎo)致造血細(xì)胞過度凋亡，進(jìn)而引起自身免疫性骨髓衰竭［4-9］。

CD8+HLA-DR+T細(xì)胞是活化的效應(yīng)T細(xì)胞亞群之一，在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病(AID)如多發(fā)性硬化癥(MS)、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)以及AIDS患者中比例升高，在HIV感染的患兒中比例明顯降低［10，11］。既往我們研究顯示，在SAA患者中CD8+HLA-DR+T細(xì)胞比例明顯增高，并隨患者病情緩解呈逐步下降趨勢(shì)，可能是導(dǎo)致SAA骨髓衰竭的主要效應(yīng)T細(xì)胞［2］。

TNF-β是由T淋巴細(xì)胞在抗原刺激下產(chǎn)生的淋巴因子，廣泛參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒作用及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)［12］。TNF分子激活后可引起受體寡聚從而增加與配體結(jié)合時(shí)的親和力，在Fas分子相關(guān)蛋白(Fas-associated death dormain，F(xiàn)ADD)分子的作用下，TNF與TNFR相互作用后，TNFR通過多聚化反應(yīng)激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并可引起線粒體膜的改變，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于TNF-α的研究較多，但缺乏TNF-β的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-β能增強(qiáng)SAA患者效應(yīng)T細(xì)胞凋亡骨髓造血細(xì)胞的作用，并且呈濃度依賴性，但在較高濃度時(shí)其凋亡細(xì)胞作用并不隨濃度增大而增高，在25 ng/ml與50 ng/ml間其凋亡細(xì)胞作用進(jìn)入平臺(tái)期，提示TNF-β也是CTL損傷骨髓造血靶細(xì)胞的重要途徑之一。但該兩組與空白對(duì)照組比較雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然實(shí)際數(shù)值差別不大，或是體內(nèi)TNF-β“溫和”的發(fā)揮造血損傷作用的實(shí)際反應(yīng)，該結(jié)論有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

INF-γ屬Th1型細(xì)胞因子，通過激活單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Gidvani等［13］檢測(cè)了與AID有關(guān)的細(xì)胞因子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，如 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β1，發(fā)現(xiàn) SAA患者均存在這些細(xì)胞因子的SNP，特別是IFN-γ和TNF-α，高度提示與SAA的發(fā)病有關(guān)。CTL一般通過三種方式殺傷靶細(xì)胞:細(xì)胞因子(TNF、IFN-γ)途徑;穿孔素、顆粒酶 B途徑;Fas-FasL途徑［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伴隨 TNF-β 濃度增加細(xì)胞凋亡率增高，培養(yǎng)體系上清中IFN-γ濃度無(wú)相應(yīng)變化，僅于50 ng/ml組有明顯增加，說明高濃度的 TNF-β可促進(jìn) CD8+HLA-DR+T細(xì)胞分泌IFN-γ。

IL-10又稱細(xì)胞因子生成抑制因子，淋巴細(xì)胞(包括CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等髓系細(xì)胞是其主要來(lái)源，具有強(qiáng)大的免疫抑制及免疫調(diào)控作用，在調(diào)節(jié)腫瘤免疫、炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)中具有多重作用。IL-10可以強(qiáng)化、延長(zhǎng)體外激活的CTL的抗腫瘤作用，抑制并逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞的凋亡過程［15-17］。本實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度TNF-β刺激下的CTL分泌IL-10水平無(wú)顯著差異，提示IL-10對(duì)CTL的正反饋?zhàn)饔迷贑TL殺傷靶細(xì)胞的過程中并非重要機(jī)制。

綜上所述，TNF-β在SAA患者CD8+HLA-DR+T細(xì)胞殺傷骨髓造血細(xì)胞過程中起重要作用，不僅是效應(yīng)T細(xì)胞損傷靶細(xì)胞重要方式之一，并可通過加強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞分泌造血抑制性因子IFN-γ起正反饋調(diào)控作用。

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