于麗梅 陳劍群 陳復(fù)興 劉軍權(quán) 周忠海 陳 玲

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科，徐州221002)

肝癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，為我國第2位惡性腫瘤致死病因，世界各地的肝癌每年新增病例約100萬［1］。早期通過手術(shù)、移植或介入等，5年生存率雖可達(dá)到70%左右;但2年復(fù)發(fā)率依然高達(dá)50%，且現(xiàn)有治療手段療效均欠佳［2］。因此如何提高肝癌患者的生存狀況，是腫瘤學(xué)界面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［3］。溶血性鏈球菌菌體制劑OK-432作為GMP(Good manufacturing products)級(jí)的免疫生物效應(yīng)修飾劑和處方藥，早已用于治療各種腫瘤［4］。OK-432可增強(qiáng) NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并促進(jìn)干擾素、IL-2、TNF-α等的分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)［5］。較其它DC成熟誘導(dǎo)劑相比，促進(jìn)未成熟樹突狀細(xì)胞(immature DC，imDC)成熟的能力更強(qiáng)，而且具有更好的應(yīng)用前景［6-10］。近年腫瘤免疫治療已成為一種新的治療模式，而在腫瘤免疫中NK細(xì)胞構(gòu)成第一道免疫殺傷防線，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，而樹突狀細(xì)胞是人體內(nèi)抗原遞呈功能最強(qiáng)的細(xì)胞，是啟動(dòng)、調(diào)控、維持免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)［11，12］。DC和NK細(xì)胞之間存在復(fù)雜的雙向通信，兩者的相互作用不僅影響了免疫反應(yīng)的啟動(dòng)，而且決定其結(jié)局。其中應(yīng)用DC與NK細(xì)胞體外共培養(yǎng)后聯(lián)合輸注治療惡性腫瘤的研究越來越受到重視。本研究探討OK-DC對NK細(xì)胞擴(kuò)增及其功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(FCS)、RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司;重組人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)購自廈門特寶生物工程股份有限公司;OK-432購于山東魯抗制藥公司;噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO(二甲亞砜)、FITC標(biāo)記的CD16/CD56購于Sigma公司;鼠抗人PE 標(biāo)記的 CD1a、CD3、CD86、CD80，鼠抗人 FITC 標(biāo)記的CD83購于BD公司;乳酸脫氫酶試劑盒購于日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社;PE標(biāo)記的穿孔素、顆粒酶B及APC標(biāo)記的鼠抗人CD107a購于杭州聯(lián)科生物;人肝癌HepG2細(xì)胞株由徐州醫(yī)學(xué)院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人類外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離、DC 培養(yǎng)［13］，于第6天時(shí)將DC分2組:(1)imDC組:不加OK-432;(2)OK-DC組:加入終濃度為5μg/ml的OK-432。48小時(shí)后FCM檢測CD1a、CD83高表達(dá)，收獲DC與NK細(xì)胞混合培養(yǎng)。

NK細(xì)胞培養(yǎng)用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整人PBMC濃度為2×105ml－1，加入6孔板，每孔4 ml，并加入 rhIL-2(終濃度 500 U/ml)，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天半量換液并補(bǔ)足rhIL-2。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 NK細(xì)胞于培養(yǎng)8天后收集細(xì)胞，分組處理如下:(1)對照組:單純NK組;(2)OKDC 組:OK-DC 與 NK 細(xì)胞以 1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例混合;(3)imDC組:imDC與NK細(xì)胞以(2)的比例分組，補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子。

1.2.3 MTT法檢測OK-432對DC增殖影響 取培養(yǎng)6天的DC，接種于96孔板中，0.2 ml/孔，細(xì)胞濃度為1 × 106ml－1，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入 OK-432(終濃度分別為 80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 μg/ml)，同時(shí)設(shè)不加藥物的對照組，每組5個(gè)復(fù)孔。孵育48小時(shí)后每孔加MTT液(5 mg/ml)20 μl，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，棄上清，加入DMSO 150μl，在570nm波長酶標(biāo)儀上測定各孔光密度值(OD)。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值－1)×100%。

1.2.4 NK 細(xì)胞增殖檢測 分別于共培養(yǎng) 0、2、4、6天取少許細(xì)胞懸液用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞存活率，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每樣本NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)=計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞總數(shù)×本樣本CD3－CD16+56+表達(dá)百分率/(初始細(xì)胞數(shù)×初始細(xì)胞CD3－CD16+56+表達(dá)百分率)。

1.2.5 FCM檢測DC表型表達(dá) 收集各組DC，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×107ml－1，按照試劑說明加入CD80、CD83、CD86 抗體，37℃避光孵育 15 分鐘，洗滌后流式細(xì)胞儀檢測表型表達(dá)情況。

1.2.6 FCM 檢測 NK 細(xì)胞表面 PFP、GraB、CD107a表達(dá) 收集各組細(xì)胞，每管加入相應(yīng)量CD3、CD56抗體及PFP、GraB、CD107a抗體，混勻后室溫暗處結(jié)合15分鐘，離心后加入PBS重懸細(xì)胞，然后上機(jī)檢測。

1.2.7 LDH釋放法檢測NK細(xì)胞殺傷活性 收集經(jīng)DC作用的NK細(xì)胞和本室液氮復(fù)蘇后的HepG2細(xì)胞，生理鹽水洗滌，調(diào)整各組NK細(xì)胞和HepG2細(xì)胞濃度分別為2 ×106ml－1和2 ×105ml－1，使效靶細(xì)胞比例為10∶1?；旌虾笾糜?7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)，1500 r/min離心10分鐘，收集上清液。全自動(dòng)生化分析儀340 nm波長下測定上清液吸光度值(A)，每樣本設(shè)5個(gè)復(fù)管。殺傷活性(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組)/(A靶細(xì)胞最大釋放組-A靶細(xì)胞自然釋放組)×100%。

2 結(jié)果

2.1 OK-432對 DC增殖的影響 OK-432(5 μg/ml)作用DC 48小時(shí)后，DC的增殖率較對照組和其它各個(gè)濃度組顯著增高，增殖達(dá)到最佳(30%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余各組間比較無顯著差異。OK-432濃度超過5 μg/ml和低于5 μg/ml時(shí)DC的增殖率均逐漸下降，見圖1。

2.2 NK細(xì)胞擴(kuò)增 NK和DC共培養(yǎng)第4天時(shí)1∶5(OK-DC)組、1∶20(OK-DC)組 NK 細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于對照組，并高于同比例未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);于第6天時(shí)1∶5(OK-DC)組NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)最大，且高于1∶20(OK-DC)組和其它各組(P ＜0.05)，見表1。

2.3 DC免疫表型檢測 處理組較對照組能顯著增強(qiáng) CD80、CD83、CD86 的表達(dá)(P ＜0.05);5 μg/ml組與對照組、1.25 μg/ml組、20 μg/ml組相比，CD80、CD83、CD86分子的表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)，見表2 及圖2 ～4。

圖1 不同濃度OK-432對DC增殖的影響(±s，n=5)Fig.1 The effect of different concentrations of OK-432 on DC growth(±s，n=5)

表1 NK細(xì)胞增殖倍數(shù)Tab.1 The multiplication of NK cells

2.4 NK細(xì)胞釋放 PFP、GraB、CD107a的檢測 NK與DC共培養(yǎng)4天后，各組釋放 PFP、GraB、CD107a較對照組明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);1∶5(OK-DC)組與1∶5(imDC)組兩組間相比有顯著差異(P ＜0.05)，1∶20(OK-DC)組與1∶20(imDC)組兩組間也有明顯差異(P＜0.05);1∶5(OK-DC)組與1∶20(OK-DC)組兩組相比有明顯差異(P ＜0.05)，見表3。

表2 不同濃度OK-432刺激的DC表型表達(dá)Tab.2 The expression of CD80，CD83 and CD86 of DC stimulated by different concentrations of OK-432

圖2 OK-432作用于DC 48小時(shí)后的CD80檢測結(jié)果Fig.2 The CD80 expression of DC stimulated by OK-432 after 48 hours

圖3 OK-432作用DC 48小時(shí)后CD80的表達(dá)(±s，n=5)Fig.3 The CD80 expression of DC cultured with OK-432 for 48 hours(±s，n=5)

圖4 OK-432作用于DC 48小時(shí)后的CD83、CD86檢測結(jié)果Fig.4 The CD83，CD86 expression of DC stimulated by OK-432 after 48 hours

表3 NK細(xì)胞PFP、GraB、CD107a的流式檢測結(jié)果Tab.3 The FCM result of PFP，GraB，CD107a in the NK cells

2.5 NK細(xì)胞殺傷活性的檢測 NK與DC共培養(yǎng)4天后，1∶5(OK-DC)組對HepG2細(xì)胞的殺傷活性(67.12±5.36)%達(dá)到最大，顯著高于對照組的(50.23 ± 4.02)%、1∶5(imDC)組的(63.11 ±5.46)%和1∶20(OK-DC)組的(58.42 ±4.31)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);1∶20(OK-DC)組與1∶20(imDC)組兩組的殺傷活性(58.42 ±4.31)%、(55.34 ±3.43)%相比差異顯著(P ＜0.05)，各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較亦有顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

在肝癌患者過繼免疫治療中，NK細(xì)胞顯示出一定抗腫瘤療效。NK細(xì)胞可以在細(xì)胞、分子及基因水平抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，具有天然殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，最新研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞還具有適應(yīng)性免疫的特性［14，15］。

Buentke等［16］通過取感染馬拉色霉菌的患者皮膚NK和DC組織，觀察到密切接觸DC的NK細(xì)胞明顯增多，首次揭示NK、DC在體內(nèi)具有相互作用。目前研究發(fā)現(xiàn)在感染或腫瘤免疫應(yīng)答中均發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞與 DC 之間有相互作用［17］。Granucci等［18］指出DC分泌的IL-2可以促使NK細(xì)胞活化，而且IL-2似乎比白細(xì)胞介素12(IL-12)或白細(xì)胞介素18(IL-18)更能誘導(dǎo)它產(chǎn)生干擾素 γ(Interferonγ，IFN-γ)。將NK細(xì)胞和未致敏DC通過過繼免疫的方法聯(lián)合輸入腫瘤病人體內(nèi)，可增加二者直接接觸和相互作用的機(jī)會(huì)，制造一種“適宜的免疫微環(huán)境”，促使NK直接殺傷腫瘤細(xì)胞，釋放抗原，并利用DC天然的抗原識(shí)別、加工和提呈能力，誘發(fā)DC特異性致敏，促使DC成熟，啟動(dòng)初始免疫，進(jìn)而推動(dòng)繼發(fā)免疫的進(jìn)行，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)的免疫應(yīng)答。NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞主要是通過PFP和GraB引起靶細(xì)胞的裂解［19］。穿孔素是存在于NK細(xì)胞胞質(zhì)中的細(xì)胞毒顆粒，能以鈣離子依賴方式在靶細(xì)胞膜上形成跨膜通道，導(dǎo)致靶細(xì)胞滲透性溶解［20］。GraB不能單獨(dú)進(jìn)人靶細(xì)胞內(nèi)，它必須在PFP使靶細(xì)胞形成孔后才能通過孔進(jìn)入，并激活膜上的蛋白酶而引發(fā)凋亡［21，22］。研究認(rèn)為，穿孔素能夠降低內(nèi)體膜穩(wěn)定性從而促進(jìn)GraB的內(nèi)化及釋放［23］。GraB具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性，除可在胞漿中激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinasparate protease，Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡外，還可直接遷移至細(xì)胞核降解脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)，誘導(dǎo)Caspase非依賴的細(xì)胞死亡［24］。此外，NK細(xì)胞表面表達(dá)Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related opoptosis-inducing ligand，TRA IL)可通過與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合引起靶細(xì)胞的凋亡。NK細(xì)胞也可被腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)激活殺傷靶細(xì)胞［25］。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)OK-432(終濃度5 μg/ml)促進(jìn)DC增殖并促進(jìn)CD80、CD83、CD86的高表達(dá)，也即能促進(jìn)DC成熟。因?yàn)镈C只有經(jīng)促成熟因子作用，才能成為成熟 DC，并且高表達(dá) CD1a、CD80、CD83、CD86等分子，其中CD83是DC成熟的標(biāo)志。DC和NK細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，1∶5組NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于其它各組，且同比例OK-DC組擴(kuò)增明顯高于im-DC組，證實(shí)OK-DC能以劑量依賴的方式增加NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)CD107a是NK細(xì)胞活化的一個(gè)重要標(biāo)志，與細(xì)胞毒活性密切相關(guān)，可作為NK 細(xì)胞功能活性的指標(biāo)［26，27］，且 CD107a 表達(dá)水平的上調(diào)與NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的增多及NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用的增強(qiáng)高度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)1∶5(OK-DC)組釋放 PFP、GraB、CD107a與其它各組相比差異顯著，證實(shí)了OK-DC能以劑量依賴的方式增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能，以1∶5比例達(dá)到最佳。這也符合 Piccioli等［28］觀點(diǎn)，NK、DC 通過細(xì)胞間的直接接觸起作用，而且以1∶5的最佳比例起作用。NK、DC相互作用不僅存在作用部位差異，還存在接觸依賴性和劑量依賴性。LDH釋放法檢測NK細(xì)胞殺傷活性，顯示1∶5(OK-DC)組對HepG2細(xì)胞的殺傷活性達(dá)到最大。提示NK細(xì)胞和DC共培養(yǎng)能增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能，從而增強(qiáng)了NK細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞的活性，可能與增加 NK擴(kuò)增倍數(shù)和 PFP、GraB、CD107a的表達(dá)有關(guān)。

OK-DC與NK細(xì)胞共培養(yǎng)在腫瘤免疫治療中的研究目前尚未有系統(tǒng)報(bào)道，因此兩者的共作用有望成為腫瘤免疫治療的新熱點(diǎn)。

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