陳 爽 林 靜 崔 善 張慶鎬 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部，延吉133002)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是世界范圍內(nèi)最為常見的慢性呼吸道疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、環(huán)境、行為、心理和機(jī)體免疫等諸多方面因素。目前認(rèn)為，Th1/Th2亞群數(shù)目和/或功能比例失衡與哮喘的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，而研究表明IL-27與Th1/Th2關(guān)系密切，因此，IL-27成為與哮喘相關(guān)的候選基因。從2007年開始陸續(xù)有學(xué)者報(bào)道IL-27啟動(dòng)子區(qū)的g.-964位點(diǎn)與哮喘患者易感性的相關(guān)性研究。其中chase等韓國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-27的g.-964位點(diǎn)可能與韓國(guó)人群哮喘易感性相關(guān)［1］，張慶鎬等發(fā)現(xiàn)IL-27p28基因多態(tài)位點(diǎn)g.-964可能與朝鮮族人群哮喘易感性相關(guān)［2］，而邱熔芳等［3］研究發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群哮喘無顯著相關(guān)性。為明確IL-27p28基因中g(shù).-964、g.2905和g.4730位點(diǎn)與哮喘人群的相關(guān)性是否具有民族差異和地區(qū)差異，本實(shí)驗(yàn)選用東北地區(qū)漢族200例哮喘患者和111例正常人血液，采用PCR法擴(kuò)增目的基因片段，單堿基延伸法進(jìn)行基因分型分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取200例中國(guó)東北地區(qū)漢族哮喘患者作為病例組，其中男82例，女118例，平均年齡32.8歲，來自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院和吉林市第二中心醫(yī)院。所有患者符合哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn):①反復(fù)發(fā)作喘息和呼吸困難、胸悶或咳嗽，多與接觸變應(yīng)原病毒感染運(yùn)動(dòng)或某些刺激物有關(guān);②發(fā)作時(shí)雙肺聞及散在或彌漫性以呼氣期為主的哮鳴音;③上述癥狀可自行或治療緩解;④排除可引起喘息或呼吸困難的其它疾病。所收集患者標(biāo)本IgE﹥800 U/ml。對(duì)照組為111例中國(guó)東北地區(qū)漢族人，男69例，女42例，平均年齡27.8歲，為延邊大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者。無過敏性哮喘及其他過敏性癥狀和病史。所有入選個(gè)體均為無血緣關(guān)系的漢族個(gè)體、長(zhǎng)期生活在東北(生活在東北地區(qū)三代或以上)，無糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及HLA相關(guān)疾病及家族史。

1.2 方法

1.2.1 人基因組DNA的提取和純化 病例組采用Bioteke凝固血基因組DNA小量提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GeneBank上找到的IL-27的基因序列(NC-000016.9)，用軟件primer5.0設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的包含啟動(dòng)子區(qū)g.-964T＞C和外顯子區(qū)g.2905T＞G，g.4730T＞C的3對(duì)引物。g.-964T＞C引物序列為 5＇-AATGTCCCGGCTGTGTCTGT-3＇(上游引物)，5＇-CTGTGCTGGAAGGGAGACCT-3＇(下游引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度321 bp;g.2905T＞G引物序列為5＇-GCTCAGCCTGTTGCTGCTTC-3＇(上游引物)，5＇-CTCCACCAGCCCTCACTCAC-3＇(下 游 引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度375 bp;g.4730T＞C引物序列 5＇-GGGTGTGATATGGCCATCCT-3＇(上游引物)，5＇-GCTCTACCTGGAAGCGGAGG-3＇(下 游 引物)，擴(kuò)增片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度226 bp。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 10×PCR Buffer(contains no MgCl2)1.5 μl-1，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)1 μl，Ampli Taq Gold(5 U/μl)0.2 μl，Template(50 ng/μl)2 μl，Primer F(20 pmol/L)0.4 μl，Primer R(20 pmol/L)0.4 μl，加滅菌去離子水補(bǔ)足至終體積15 μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 5分鐘;94℃變性 30秒，65℃退火1分鐘，72℃延伸45秒，每個(gè)循環(huán)溫度遞減0.5℃，共10個(gè)循環(huán);94℃變性30秒，65℃退火1分鐘，72℃延伸45秒，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸3分鐘，4℃終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物1 μl加緩沖液0.5×TBE，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色觀察結(jié)果，分析PCR擴(kuò)增情況。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化 取100 μl滅菌去離子水到反應(yīng)孔中，充分吹打混勻后，取100 μl到純化板中，抽空。注意觀察，勿抽過度。加滅菌去離子水100 μl，再次抽空。加滅菌去離子水補(bǔ)到原液量，搖床搖20分鐘。震蕩后離心1 000 r/min 3分鐘。

1.2.5 測(cè)序 311例樣本純化后產(chǎn)物均進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所用試劑盒BigDye Terminator v3.1，測(cè)序反應(yīng)在ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀中進(jìn)行，由國(guó)家人類基因組北方研究中心完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Hardy-weinberg平衡吻合度(HWE)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)出三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在哮喘組和對(duì)照組中預(yù)期的基因型頻率，確定所選哮喘組和對(duì)照組是否可以代表東北漢族群體?；蛐图暗任换蝾l率用直接記數(shù)法依公式算出。應(yīng)用SPSS17.0檢測(cè)IL-27三個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在哮喘組及對(duì)照組中是否存在顯著性差異，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增效果 IL-27p28的三個(gè)位點(diǎn)啟動(dòng)子區(qū)域的g.-964T＞C、外顯子區(qū)域的g.2905T＞G和g.4730T＞C應(yīng)用3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳20分鐘，在凝膠成像分析儀下成像，所得PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期的產(chǎn)物一致(圖1)。

2.2 IL-27p28基因中查找SNP位點(diǎn)以及大樣本基因分型 對(duì)正常人和哮喘患者樣本IL-27p28基因啟動(dòng)子、外顯子及其附近的內(nèi)含子區(qū)域直接測(cè)序(圖2～4)。根據(jù) LD以及 SNPs的位置，在所有合格測(cè)序結(jié)果中選擇其中g(shù).-964A＞G互補(bǔ)鏈g.-964T＞C和g.2905T＞G、g.4730T＞C進(jìn)行大樣本基因分型。

圖1 IL-27基因g.－964位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig．1 Electrophoresis result of PCR products on g.－964 site of IL-27 gene

圖2 IL-27p28基因g．－964T＞C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(TC雜合型)Fig．2 Sequencing map of IL-27p28(g．－ 964T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

圖3 IL-27p28基因g．2905T＞G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(TT純合型)Fig．3 Sequencing map of IL-27p28(g．2905T ＞ G)gene PCR products(TT homozygous)

圖4 IL-27p28基因g．4730T＞C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(TC雜合型)Fig．4 Sequencing map of IL-27p28(g．4730T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

表1 哮喘組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率Tab．1 Genotype and allele frequencies in asthma and control groups

2.3 IL-27p28的SNPs與哮喘的相關(guān)性分析 本實(shí)驗(yàn)對(duì)200名哮喘患者和111名正常人進(jìn)行檢測(cè)。由于樣本為三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律P＞0.05，證明所收集樣本可以代表群體。組間基因型及等位基因的比較運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果IL-27p28的 g.-964T＞C、g.2905T＞G和g.4730T＞C的基因型及等位基因頻率的分布在正常對(duì)照組和哮喘組之間的分布均無顯著性差異(表1)。

3 討論

白細(xì)胞介素27(Interleukin 27，IL-27)是由P28和EBi3兩個(gè)片段組成的異源二聚體，在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上有較高水平表達(dá)，主要作用于固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞而發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，尤其在調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化與增殖方面具有重要作用［4］。已知CD4+T細(xì)胞活化后，在不同細(xì)胞因子的作用下可分化為Th1或Th2，Th1細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)細(xì)胞免疫;Th2細(xì)胞分秘IL-4，促進(jìn)體液免疫。Th1和Th2細(xì)胞可通過分泌的細(xì)胞因子而互相抑制其分化和增殖，Th2型細(xì)胞應(yīng)答亢進(jìn)是Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要致病機(jī)制，而支氣管哮喘恰恰是典型的Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病。IL-27能協(xié)同IL-12促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并促進(jìn) Th0細(xì)胞向 Th1 細(xì)胞分化［5，6］;同時(shí)，IL-27 還具有抑制效應(yīng)Th2細(xì)胞功能的作用［7］。因此，IL-27很有可能成為較好的治療Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病的細(xì)胞因子。

Th1/Th2失衡學(xué)說是哮喘發(fā)作的重要免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，在體外實(shí)驗(yàn)中，IL-27可以通過誘導(dǎo)T-bet和IL-12Rβ2的表達(dá)啟動(dòng)初始T細(xì)胞向Th1的分化［8，9］，另外，IL-27 可以抑制 Th2 特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)，因而IL-27能夠使Th1/Th2平衡向Th1漂移。而體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，IL-27對(duì)免疫反應(yīng)有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，IL-27ra-/-小鼠在受到病原體刺激時(shí)，會(huì)引起持續(xù)的Th1活化，最終導(dǎo)致組織器官損傷，甚至死亡［10，11］，因此，IL-27 對(duì)于抑制過度的免疫反應(yīng)有著重要的意義。綜上所述，IL-27在維持Th1/Th2平衡及抑制過度免疫方面有著重要作用，而IL-27的表達(dá)異常有可能導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生。

隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析方法大規(guī)模的應(yīng)用，越來越多的哮喘易感基因被鑒定，但由于各種外在和內(nèi)在因素的作用，使這些結(jié)果需要在不同的人群中進(jìn)行重復(fù)和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)對(duì)g.-964A＞G、g.2905T＞G、g.4730T＞C的3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行研究，通過病例-對(duì)照研究對(duì)IL-27基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，未測(cè)到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與中國(guó)東北漢族人群哮喘相關(guān)。g.-964A＞G檢測(cè)結(jié)果正與中國(guó)學(xué)者對(duì)漢族人的檢測(cè)相一致，與對(duì)朝鮮族人檢測(cè)的結(jié)果有所不同，故懷疑g.-964 A＞G位點(diǎn)與哮喘易感性之間的關(guān)系可能具有種族特異性，所以該位點(diǎn)在漢族和朝鮮族人群之間重復(fù)性有差別。而g.2905T＞G、g.4730T＞C兩個(gè)位點(diǎn)在漢族和朝鮮族人群中基因多態(tài)性與支氣管哮喘均無相關(guān)性，因此這兩個(gè)位點(diǎn)可能不是哮喘易感性的相關(guān)位點(diǎn)。支氣管哮喘是多因素誘發(fā)的疾病，目前臨床上無較好的預(yù)防和根治的辦法，IL-27基因多態(tài)性與哮喘相關(guān)性的研究為哮喘的預(yù)防提供了新的遺傳學(xué)研究方向，有望成為部分人群診斷和預(yù)防支氣管哮喘的一種依據(jù)。

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