丁曉燕,方廖瓊,張 弘,喬 海,王智彪

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系,省部共建超聲醫(yī)學(xué)工程國家重點實驗室,超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級重點實驗室,重慶 400016)

胚胎早期分化的機(jī)理是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中的重要基礎(chǔ)性課題之一,因推測其與腫瘤形成的機(jī)理相關(guān),故倍受關(guān)注,然而目前尚無定論[1]。在研究胚胎分化或其他相關(guān)生命活動時,如判斷早期胚胎質(zhì)量,需要測量其膜電位的變化作為指標(biāo)。雖然膜電位測定儀在測量膜電位方面的應(yīng)用已經(jīng)比較成熟[2],但其用于胚胎細(xì)胞時需用酸性臺氏液除去透明帶,很容易傷害胚胎細(xì)胞導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確,且技術(shù)水平要求較高、操作復(fù)雜,因此用膜電位測定儀測量胚胎細(xì)胞的膜電位有一定的局限性。

電壓敏感染料的出現(xiàn)給觀測胚胎細(xì)胞膜電位的變化提供了一種可能的、操作簡便且不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法。DiBAC4(3)是一種膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料[3],由于它的負(fù)離子特性,它會隨著細(xì)胞膜電位的變化進(jìn)出細(xì)胞膜從而保持膜內(nèi)外電荷的動態(tài)平衡。

DiBAC4(3)已經(jīng)被用于很多微需氧微生物的研究,其中包括腸賈第鞭毛蟲、陰道毛滴蟲、胎兒三毛滴蟲、六鞭毛蟲[4]。但目前尚未見DiBAC4(3)用于胚胎細(xì)胞的研究,由于DiBAC4(3)是親脂性染料,易與蛋白結(jié)合[5],而在囊胚期以前的胚胎被主要成分是糖蛋白的透明帶包裹,所以用DiBAC4(3)給胚胎細(xì)胞染色時可能會受到透明帶的影響,而無法準(zhǔn)確檢測細(xì)胞膜電位的動態(tài)變化。本實驗選取囊胚期以前的三個時期的胚胎,對DiBAC4(3)檢測細(xì)胞膜電位動態(tài)變化的可行性進(jìn)行研究,為胚胎的膜電位檢測探索新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

性成熟昆明小鼠購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。雌鼠6～8周齡,體重25～30 g;雄鼠8～10周齡,體重30～35 g。飼養(yǎng)條件為自由攝食、飲水,12 h光照,環(huán)境溫度18℃～22℃,相對濕度60%～80%。雌鼠超排卵(腹腔注射孕馬血清PMSG 7.5單位/只48 h后腹腔注射獸用絨毛膜促性腺激素HCG 7.5單位/只)后與雄鼠1∶1合籠,次日晨發(fā)現(xiàn)有陰栓者為妊娠第一天(D1)孕鼠。

1.2 藥品和試劑

PMSG(寧波第二激素制品廠),HCG(麗珠制藥公司),DiBAC4(3)(Molecular Probes,Eugene,OR)溶于DMSO(美國Sigma公司),配制成1 mmol/L儲備液并分裝,用Ham's F12/DMEM液體培養(yǎng)基(Hyclone公司)稀釋成終濃度為10 μ mol/L溶液待用。KCL溶于Ham's F12/DMEM配成濃度500 mmol/L溶液。M2和M16(EmbryoMax,MR-015P-5F)。

1.3 儀器設(shè)備

一次性無菌培養(yǎng)皿(Corning,America),TC2323型二氧化碳孵箱(Shel-Lab,America),LX70型倒置顯微鏡(Olympus,Japan),SZX12型體視顯微鏡(Olympus,Japan),激光共聚焦顯微鏡(Leica,Germany)。

1.4 胚胎細(xì)胞的準(zhǔn)備

分別取D1、D2孕鼠,脫頸處死,75%酒精常規(guī)消毒,開腹后剪取雙側(cè)輸卵管,放入加有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,在體視顯微鏡下剝離輸卵管壺腹部后,挑選發(fā)育形態(tài)正常的單細(xì)胞、二細(xì)胞期胚胎。取D3孕鼠,75%酒精常規(guī)消毒,開腹后剪取雙側(cè)子宮,放入加有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用注射器沖洗子宮數(shù)遍后,在體視顯微鏡下挑選發(fā)育形態(tài)正常的囊胚。將取得的胚胎細(xì)胞用FD沖洗后吸入M2液滴中,于37℃、5%CO2、相對濕度為95%～100%的孵箱中孵育5 min后,分成兩組(實驗組與對照組)放入M16中于溫箱中孵育30 min。

1.5 孵育和染色

M16中孵育30 min后在實驗組和對照組中分別加入DiBAC4(3)至終濃度為 5μ mol/L,5 min時在熒光顯微鏡下觀察染色情況,后每隔10 min在熒光顯微鏡下觀察一次。

1.6 KCL去極化

加DiBAC4(3)30 min后在實驗組中加入500 mmol/L的KCL溶液至終濃度為100 mmol/L,即刻在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度的變化,后每隔5 min觀察一次;對照組中同時加與KCL等體積的M16,即刻在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度的變化,后每隔5min觀察一次。

2 結(jié)果

2.1 胚胎細(xì)胞的染色情況

在激光共聚焦顯微鏡下可以清晰地看到,胚胎細(xì)胞成綠色熒光(圖1 a),而透明帶未被染色(圖1 c),DiBAC4(3)可以透過胚胎的透明帶進(jìn)入胚胎細(xì)胞內(nèi)(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.2 胚胎細(xì)胞去極化時熒光強(qiáng)度的變化

實驗組在加入KCL后,胚胎細(xì)胞發(fā)生去極化,即刻胚胎細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著增加(圖2 a,b),對照組胚胎的熒光強(qiáng)度無顯著變化(圖2 c,d,圖2見彩圖頁Ⅱ)。激光共聚焦顯微鏡顯示在加入KCL之前的30 min內(nèi),實驗組與對照組的熒光強(qiáng)度隨時間逐漸增大,加入KCL之后,實驗組熒光強(qiáng)度顯著增加,而對照組無明顯變化(圖3)。

Fig.3 Comparison of fluorescence intensity changes between the experiment group and control group(The value of fluorescence intensity was given by laser scanning confocal microscope)

2.3 不同發(fā)育階段的胚胎細(xì)胞染色比較

分別將單細(xì)胞期、二細(xì)胞期和囊胚期的胚胎細(xì)胞的染色情況進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同時期的胚胎細(xì)胞均可以被DiBAC4(3)染色,且在加KCL去極化即刻均有顯著的熒光強(qiáng)度的變化(圖4見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

生物電現(xiàn)象是一種普遍存在而又十分重要的生命現(xiàn)象。細(xì)胞的生物電現(xiàn)象主要有兩種形式:一種是安靜(未受刺激)時所具有的靜息電位,另一種是受刺激時產(chǎn)生的動作電位。本實驗采用KCL對胚胎細(xì)胞進(jìn)行刺激使其產(chǎn)生動作電位,加KCL后由于細(xì)胞膜內(nèi)外的鉀離子平衡的改變導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生去極化,使細(xì)胞內(nèi)的電位升高,而DiBAC4(3)染料分子受正電位的影響會由膜外迅速進(jìn)入到膜內(nèi)引起熒光強(qiáng)度的瞬間增強(qiáng),并在一段時間內(nèi)與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)結(jié)合而引起細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的緩慢增強(qiáng)[5]。實驗結(jié)果顯示胚胎細(xì)胞的染色不受透明帶的影響,可能原因為透明帶中的糖蛋白為小分子蛋白,不會大量積聚染料而造成細(xì)胞染色的失敗。

分別將單細(xì)胞期、二細(xì)胞期和囊胚期的胚胎細(xì)胞的染色情況進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同時期的胚胎細(xì)胞均可以被DiBAC4(3)染色,且在加KCL去極化即刻均有顯著的熒光強(qiáng)度的變化,說明DiBAC4(3)可以用于檢測單細(xì)胞期、二細(xì)胞期及囊胚期胚胎膜電位的動態(tài)變化。同時實驗結(jié)果表明同一胚胎期的不同胚胎細(xì)胞、不同胚胎期的細(xì)胞、同一胚胎期的內(nèi)層細(xì)胞與外層細(xì)胞染色存在一定差異,這可能與它們的膜電位不同有關(guān),有研究推測這種膜電位的差別正是胚胎細(xì)胞發(fā)生分化的誘因[1]。

本研究通過觀察KCL使單細(xì)胞期胚胎、二細(xì)胞期胚胎、囊胚期胚胎去極化膜電位變化時,相應(yīng)的DiBAC4(3)染色后熒光強(qiáng)度的變化,證明了電壓敏感染料DiBAC4(3)可以用于檢測胚胎細(xì)胞膜電位的動態(tài)變化。

[1]穆 祥,楊佐君,倪和民,等.小鼠早期胚胎細(xì)胞膜電位的測定及胚胎早期分化誘因的探討[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2004,19(4):29-33.

[2]Brauner T,Hülser D F,Strasser R J.Comparative measurements of membrane potentials with microelectrodes and voltage-sensitive dyes[J].Biochim Biophys Acta,1984,771(2):208-216.

[3]Wilson H A,Chused T M.Lymphocyte membrane potential and Ca2+-sensitive potassium channels described by oxonol dye fluorescence measurements[J].J Cell Physiol,1985,125(1):72-81.

[4]Bankers-Fulbright J L,Gleich G J,Kephart G M,et al.Regulation of eosinophil membranedepolarization during NADPH oxidase activation[J].J Cell Sci,2003,116(pt 15):3221-3226.

[5]Epps D E,Wolfe M L,Groppi V.Characterization of the steady-state and dynamic fluorescence properties of the potential-sensitive dye bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol(Dibac4(3))in model systems and cells[J].Chem PhysLipids,1994,69(2):137-150.