杜愛林,李 爽,姜洪波,李文強,郝 偉,張瑞嶺△

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學教研室,2.河南省生物精神病學重點實驗室,3.二附院,4.三附院,新鄉(xiāng) 453003)

酒精依賴或稱為酒癮,是一種非要飲酒不可的強迫心理狀態(tài),可以連續(xù)或周期性出現(xiàn)。丁苯酞(butylphthalide,NBP)是我國成功研制出的具有自主知識產(chǎn)權的一類化學新藥,主要用于治療缺血性腦卒中。研究表明,NBP可抑制谷氨酸釋放,抑制Ca2+內(nèi)流[1]。本實驗通過觀察NBP作用于酒精依賴大鼠后,戒斷癥狀評分、海馬谷氨酸(Glu)含量及N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate acceptor)2B亞基(NR2B)mRNA表達變化,探討NBP對酒精依賴大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備

鄭州大學動物中心提供清潔級成年健康SD雄性大鼠50只(許可證號:scxk(豫)2005-0001),體重200～220 g,隨機分為五組(n=10),分別為A:正常組,B:酒精依賴模型組,C:NBP低劑量組,D:NBP中劑量組,E:NBP高劑量組,各組平均體重差別無統(tǒng)計學意義。除正常組外,各組飲含6%(v/v)酒精水溶液28 d[2]。14 d后,NBP用植物油稀釋后每日灌胃一次,劑量為低劑量組NBP 10 mg/kg,中劑量組NBP 20mg/kg,高劑量組NBP 40 mg/kg,正常組和酒精依賴模型組等劑量植物油灌胃5 ml/kg。

1.2 藥品及試劑

丁苯酞由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供。Trizol試劑、SYBR·Premix Ex TaqTM II試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司、引物由上海生工生物工程有限公司合成。谷氨酸標準液購自上?？颠_氨基酸廠。

1.3 戒斷評分

各組動物按Erden等[3]戒斷評分表于末次飲酒后6 h觀察戒斷癥狀18 min。主要觀察指標為大鼠戒斷行為體征(刻板行為、激惹性、尾巴強直、異常姿勢)和聽源性癲癇發(fā)作情況。

1.4 高效液相色譜分析谷氨酸水平[4]

大鼠麻醉斷頭,剝離海馬稱重,加入1 ml甲醇-水離心液,低溫勻漿,取部分勻漿液4℃,10 000×g,離心15 min,取上清,濾膜過濾后-80℃保存待測。組織中含量以μ g/g計。樣品經(jīng)OPA(O-phthalaldehyde)衍生后,用高效液相色譜儀(美國VARIAN Prostar)分析。流速1.0ml/min、激發(fā)波長250 nm,發(fā)射波長410 nm,以GLU峰面積定量。

1.5 實時熒光定量PCR反應

1.5.1 cDNA制備 快速斷頭處死各組試驗動物,冰盤上操作取海馬區(qū)腦組織50～100 mg,立即放入Trizol試劑中進行RNA抽提。以260 nm及280 nm吸光度值計算所獲RNA含量及純度,分裝后-70℃保存。逆轉(zhuǎn)錄過程按試劑盒說明書操作。

1.5.2 PCR引物設計 根據(jù)標準熒光定量PCR引物設計原則,通過Primer 5.0程序設計,NR2B引物序列為:上游引物:5′-CTT ACT GAA GGC AAT CCT CG-3′,下游引物:5′-TCC TCA GAA CAC CTT CGC TT-3′;ACTIN 引 物序 列 為上 游引物:5′-ATGGATGACGATATCGCTGCG-3′,下 游 :5′-TCGTCCCAGTTGGTGACAATG-3′,由上海生工生物工程公司合成。

1.5.3 PCR 過程 SYBR·Premix Ex TaqTM(2 ×)12.5 μ l、NR2B/ACTIN F(10 pmol/L)1 μ l、NR2B/ACTIN R(10 pmol/L)1 μ l、模板 cDNA 2μ l、ddH2O 8.5μ l(總體積 25μ l)于 PCR 反應管中。在FTC-2000型熒光定量PCR儀(加拿大楓嶺生物技術(上海)有限公司)上行PCR,擴增條件如下:(1)95℃3 min預變性;(2)95℃20 s變性,60℃30 s退火延伸,40個循環(huán)。

1.5.4 熒光實時定量PCR分析 分別測定每個樣品NR2B和ACTIN mR NA的Ct值,每個樣品均作復孔以減少操作誤差。采用相對定量方式表示各樣品NR2B的△Ct,△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。再依據(jù)△△Ct=△Ct目的基因△Ct參照因子,計算 2-△△Ct。對PCR反應過程中的每一循環(huán)的系統(tǒng)熒光強度進行實時監(jiān)測,根據(jù)擴增曲線確定Ct值(cycle threshold),利用2-△△Ct法計算NR2BmRNA相對拷貝數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對酒精成癮大鼠戒斷評分的影響

戒斷評分結(jié)果顯示,酒精成癮可使大鼠戒斷評分明顯增加,中高劑量丁苯酞均可使大鼠戒斷評分下降(表1)。

Tab.1 Effect of NBP on the ratswith alcohol addiction(±s,n=10)

Tab.1 Effect of NBP on the ratswith alcohol addiction(±s,n=10)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs low-dose group

Group Score withdrawal syndrome Glutamate(μ mol/g) NR2B Control 10.38±1.40 3.21±0.60 1.03±0.14 Model 13.22±2.27**0.35±0.06**3.78±0.49*Low-dose 13.51±2.63 0.31±0.07 3.21±0.65 Medium-dose 11.37±1.19#△0.29±0.07 1.37±0.89#△High-dose 11.28±1.08#△0.28±0.06 1.74±1.19#△

2.2 丁苯酞對酒精成癮大鼠海馬區(qū)谷氨酸含量的影響

高效液相色譜分析結(jié)果顯示,酒精成癮可使大鼠海馬區(qū)谷氨酸含量明顯減少,各劑量丁苯酞對酒精成癮所引起的大鼠海馬區(qū)谷氨酸含量減少沒有明顯影響(表1、圖1)。

2.3 丁苯酞對酒精成癮大鼠海馬區(qū)NR2B mRNA含量影響

熒光實時定量PCR結(jié)果顯示,酒精成癮可使大鼠海馬區(qū)NR2B mRNA表達明顯上升,中、高劑量丁苯酞使大鼠海馬區(qū)NR2B mRNA表達減少(表1、圖2)。

3 討論

丁苯酞(butylphthalide,NBP)具有較強的抗腦缺血作用,能改善腦能量代謝和缺血腦區(qū)的微循環(huán),抑制神經(jīng)細胞凋亡,并具有抗腦血栓形成和抗血小板聚集作用。NBP可能通過降低花生四烯酸含量,提高腦血管內(nèi)皮NO和PGI2的水平,抑制谷氨酸釋放,降低細胞內(nèi)鈣濃度等機制而產(chǎn)生上述藥效作用。

Fig.1 HPLC chromatograms of Glu in the hippocampus of rats

本研究采用給大鼠自由飲含6%酒精(v/v)的水溶液28 d的方法,建立酒精依賴大鼠模型[2]。本研究酒精依賴模型組大鼠在酒精撤除6 h后,綜合評分明顯比正常組高,有顯著性差異,表明酒精依賴大鼠模型制作成功。給予丁苯酞(butylphthalide,NBP)中、高劑量干預后,綜合評分降低,與實驗對照組相比有顯著性差異,表明NBP能夠減輕酒精戒斷癥狀。為了探討NBP的神經(jīng)保護作用機制,我們分別檢測了大鼠海馬區(qū)谷氨酸(Glu)含量和NMDA受體亞基NR2B蛋白表達。

Fig.2 Amplification curve of NR2B mRNA in the hippocampus of rats

在哺乳動物腦內(nèi),海馬(hippocampus)與酒精成癮密切相關。而腦組織中谷氨酸(Glu)受體N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基(NR2B)在海馬組織有豐富表達。研究表明,酒精能夠通過作用于NR2B受體,造成神經(jīng)細胞損傷和成癮。本實驗結(jié)果表明,酒精成癮大鼠海馬區(qū)Glu含量較正常組顯著降低(P＜0.01),而NR2B mRNA表達明顯升高。這與既往研究結(jié)果一致。加入NBP后,酒精成癮大鼠海馬區(qū)NR2B mRNA表達明顯下降,但是海馬區(qū)Glu含量無顯著性差異(P＞0.05)。說明NBP可以下調(diào)酒精成癮引起的海馬區(qū)NR2B mRNA表達,但是其作用途徑與Glu無關。

NR2B表達上調(diào)可導致過量飲酒及復發(fā)。NMDA受體被激活后,觸發(fā)Ca2+等陽離子的內(nèi)流,使神經(jīng)元逐步壞死。NBP能夠減輕細胞內(nèi)鈣超載,NBP中、高劑量組與實驗對照組比較,海馬組織NR2BmRNA表達明顯降低,差異具有顯著性,提示NBP可能通過使NR2B mRNA表達下調(diào),使NMDAR數(shù)量減少,進而抑制Ca2+內(nèi)流,減輕細胞內(nèi) Ca2+超載,使大鼠戒斷癥狀減輕。

本研究為NBP的神經(jīng)保護作用提出了新的可能機制,對于指導酒精成癮的臨床治療也具有一定的理論意義。

[1]秦榮新,梁健成.丁基苯酞的藥理及臨床研究進展[J].海峽藥學,2009,21(1):100-101.

[2]李 菁,袁孝如,李躍華,等.酒精依賴大鼠模型建立[J].中國藥物依賴性雜志,2006,15(6):433-436.

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