朱阿楠,王淑君,王園園,金可可,王萬(wàn)鐵△

(1.溫州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,浙江 溫州 325035;2.余姚市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科,浙江 余姚 315400)

低O2高CO2性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension,HHPH)發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是肺血管阻力增加。目前研究[1,2]表明HHPH是由于多種因素刺激肺血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖,細(xì)胞外基質(zhì)成分增多,非肌型動(dòng)脈形成新肌層化,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和肥大,最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈管壁增厚和管腔狹窄所致。至今,HHPH發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制仍未闡明。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號(hào)途徑作為各種刺激因子在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的共同通路,在肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建中所起的關(guān)鍵作用,是近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

1 材料與方法

1.1 慢性HHPH動(dòng)物模型的復(fù)制

雄性SD大鼠72只(體重200～220 g),隨機(jī)分成6 組(n=12),即 N 、H3d、H1w、H2w、H4w和 Hp組 。 將后五組大鼠放入常壓低O2高 CO2艙內(nèi),艙內(nèi)O2濃度維持在9%～11%,CO2濃度維持在5%～6%(艙內(nèi)水蒸汽用無(wú)水 CaCl2吸收,多余二氧化碳用氫氧化鈉吸收),每天8 h,每周6 d。Hp組于每日進(jìn)艙前半小時(shí)腹腔注射血塞通注射液[50 mg/(kg·d)],其余各組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。N組置于艙外,自由呼吸空氣。其他組均飼養(yǎng)在常壓低O2高CO2艙內(nèi),分別飼養(yǎng)3 d(H3d組)、1周(H1w組)、2周(H2w組)、4周(H4w、Hp組)。

1.2 模型是否成功的評(píng)估

每組隨機(jī)取10只大鼠。采用右心導(dǎo)管法自頸外靜脈插管至肺動(dòng)脈,并行頸總動(dòng)脈插管,經(jīng)Power-Lab生理記錄儀分別測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)及平均頸動(dòng)脈壓(mean carotid arterial pressure,mCAP)。放血處死動(dòng)物,分別稱取右室(RV)和左室加室間隔(LV+S)的重量,并計(jì)算出RV/(LV+S)的重量比,作為右室肥大的指標(biāo)。以mPAP、mCAP 、RV/(LV+S)%、作為判斷模型建立成功的指標(biāo)。

1.3 肺細(xì)小血管顯微結(jié)構(gòu)觀察

取肺組織,常規(guī)石蠟制片(厚度 5 μ m),HE染色,顯微鏡觀察并拍照。每只大鼠隨機(jī)選一張肺組織切片,每張切片隨機(jī)選直徑50 μ m～ 200 μ m 肺細(xì)小動(dòng)脈5支,用美國(guó)IPP5.0(Image-pro plus)彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定肺細(xì)小動(dòng)脈管壁面積/管總面積(vessel wall area/total area,WA/TA),管腔面積/管總面積(vessel cavity area/total area,EA/TA)。

1.4 肺細(xì)小動(dòng)脈p38MAPK的免疫組化檢測(cè)及結(jié)果處理

肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%過(guò)氧化氫室溫處理10 min,滴加一抗(1∶100),37℃孵育1 h,再滴二抗、SABC、3,3一二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色,陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色。隨機(jī)選取直徑50～200 μ m的肺內(nèi)動(dòng)脈10條,采用美國(guó)IPP5.0(Image-pro plus)彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性部位及背景的光密度值,以陽(yáng)性部位的光密度值減背景的光密度值代表陽(yáng)性部位的吸光度(optical density,OD)值。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織中磷酸化p38MAPK蛋白含量及圖像處理

(1)各組取肺組織100 mg,剪碎、勻漿以充分裂解肺組織。超聲粉碎儀裂解細(xì)胞后吸取上清,分裝,-80℃保存。(2)BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品的蛋白濃度,調(diào)節(jié)蛋白濃度,上樣量為40 μ g。(3)蛋白質(zhì)電泳和印跡電轉(zhuǎn)移:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠和5%的濃縮膠,電泳條件:恒壓,先80 V,待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠后改電壓為130 V,直至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部;電泳結(jié)束后進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移,應(yīng)用聚乙烯二氟(PVDF)膜380 mA恒流電轉(zhuǎn)40 min,轉(zhuǎn)移完畢后分別用立春紅和考馬斯亮蘭染膜和膠。(4)Western印跡分析:采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%BSA的TBS。T封閉液室溫封閉1 h,TBS-T洗膜3次后,加入單克隆兔抗大鼠磷酸化p38或單克隆兔抗大鼠總p38(總p38為磷酸化p38起校正內(nèi)參的作用,濃度均為1∶1 000稀釋),于4℃孵育過(guò)夜,次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋),室溫置1 h;TBST洗膜3次,化學(xué)發(fā)光底物ECL顯色、膠片曝光,用UVP凝膠成像掃描系統(tǒng)對(duì)膠片條帶進(jìn)行定量性密度測(cè)定,Quantity One軟件計(jì)算其灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓、體循環(huán)壓和右心指數(shù)的比較

2.1.1 各組大鼠 mCAP的比較 N組、H3d組、H1w組、H2w組、H4w組和Hp組大鼠間mCAP無(wú)明顯差異(P＞0.05,表1),說(shuō)明低O2高CO2對(duì)大鼠的體循環(huán)壓沒(méi)有影響。

2.1.2 各組大鼠mPAP的比較 與N組相比,H3d組mPAP無(wú)明顯升高(P＞0.05)。隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng) ,H1w組 、H2w組、H4w組和Hp組的 mPAP均高于N組(P均＜0.05),且各組之間差異明顯(P＜0.05)。說(shuō)明隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠mPAP 1周時(shí)即開始明顯升高,4周后達(dá)到較高水平。同時(shí)可見 Hp組 mPAP明顯低于H4w組(P＜0.05,表1),說(shuō)明PNS可減輕低O2高CO2的肺動(dòng)脈高壓。

2.1.3 各組大鼠RV/LV+S的比較 隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng) ,H2w、H4w和Hp組的 RV/LV+S 均高于N 組(P均 ＜0.05),但H3d組、H1w組的RV/LV+S較N組增加不明顯(P均＞0.05)。說(shuō)明隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠2周后 RV/LV+S即開始明顯升高,而且逐漸增加,第4周達(dá)較高水平。同時(shí)可見Hp組 RV/LV+S明顯低于H4w組(P＜0.05,表1),說(shuō)明PNS可減輕低O2高CO2大鼠的右心室肥厚。

Tab.1 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP,mCAP,RV/LV+S of rats(±s,n=10)

Tab.1 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP,mCAP,RV/LV+S of rats(±s,n=10)

mPAP:Mean pulmonary arterial pressure;mCAP:Mean carotid arterial pressure;R V/LV+S:Right ventricle/left ventricle+septum;N:Normal group;H3d:Hypoxic hypercapnia for 3-day group;H1w:Hypoxic hypercapnia for 1-week group;H2w:Hypoxic hypercapnia for 2-week group;H4w:Hypoxic hypercapnia for 4-week group;HP:PNS-injected group*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs H3dgroup;△P ＜0.05 vs H1wgroup;▲P＜0.05 vs H2wgroup;○P＜0.05 vs H4w group

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg)RV/LV+S(%)N 11.00±0.62 107.46±6.40 23.41±0.97 H3d 11.84±0.49 110.13±5.44 24.29±1.02 H1w 13.54±0.65*# 109.19±4.99 24.76±1.04 H2w 16.85±0.88*#△ 108.03±4.9230.19±0.95*H4w 23.12±0.53*#△▲ 114.85±9.8736.04±0.65*#△Hp 18.74±0.74*#△▲○106.32±6.3431.57±0.69*#△○

2.2 光鏡下各組大鼠肺細(xì)小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的比較

光鏡下所見,N組,平滑肌層未見明顯增生,管壁均勻一致,而隨著缺氧間期的延長(zhǎng),H1w組、H2w組、H4w組和Hp組內(nèi)彈力板扭曲明顯,中膜平滑肌細(xì)胞增生,管腔明顯狹窄,但H3d組改變不明顯(圖1A,1F,圖1見彩圖頁(yè)Ⅳ)。Hp組與H4w組比較,其血管壁的改變明顯減輕(圖1E,1F)。隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng),H1w、H2w、H4w和Hp組的WA/TA 均高于N組(P均＜0.05),但H3d組較N組增加不明顯(P＞0.05)。說(shuō)明隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠1周后肺小動(dòng)脈管壁開始增厚,第4周達(dá)較高水平。同時(shí)可見Hp組WA/TA明顯低于H4w組(P＜0.05),說(shuō)明PNS可減輕低O2高CO2大鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚。EA/TA則相反(表2)。

Tab.2 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling of rats(%,±s,n=8)

Tab.2 Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling of rats(%,±s,n=8)

WA/TA:Vessel wall area/total area;EA/TA:Vessel cavity area/total area;N:Normal group;H3d:Hypoxic hypercapnia for 3-day group;H1w:Hypoxic hypercapnia for 1-week group;H2w:Hypoxic hypercapnia for 2-week group;H4w:Hypoxic hypercapnia for 4-week group;HP:PNS-injected group*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs H3dgroup;△P＜0.05 vs H1wgroup;▲P＜0.05 vs H2wgroup;○P＜0.05 vs H4w group

Group WA/TA EA/TA N 28.71±2.56 71.39±2.56 H3d 30.20±2.31 69.80±2.31 H1w 35.26±2.04*# 64.74±2.04*#H2w 44.10±2.29*#△ 55.90±2.29*#△H4w 54.98±4.21*#△▲ 45.02±4.21*#△▲Hp 46.38±1.02*#△○ 53.62±1.02*#△○

2.3 各組肺組織勻漿磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)Western blot結(jié)果比較

各組肺組織勻漿P-p38MAPK灰度值變化為N組P-p38 MAPK未見表達(dá),隨著低O2高CO2進(jìn)展,p38MAPK活性逐漸增強(qiáng),H1w組達(dá)到高峰(圖2),灰度值(0.362±0.087),此后一直維持在較高水平,H2w、H4w和H1w組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Hp組 P-p38 MAPK明顯低于H1w、H2w、H4w組但仍高于正常對(duì)照組水平(P＜0.05,表3)。

Fig.2 Western blot analysis of P-p38MAPK expression in lung homogenate

2.4 各組肺小血管壁磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)變化

各組肺小動(dòng)脈壁 P-p38MAPK蛋白吸光度值比較N組和H3d組肺小動(dòng)脈壁P-p38MAPK表達(dá)呈陰性或弱陽(yáng)性(圖3A、3B,圖3見彩圖頁(yè)Ⅳ),隨著低O2高CO2進(jìn)展,其在肺小動(dòng)脈壁上的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(表4),低氧1周時(shí)P-p38MAPK在大鼠肺小動(dòng)脈壁核表達(dá)呈陽(yáng)性(圖3C),低O2高CO2兩周,4周時(shí)也有較強(qiáng)活性(圖3D,3E)。PNS治療組P-p38MAPK表達(dá)減弱(圖3F,表3)

Tab.3 Western blot analysis of P-p38MAPK expression in lung homogenate(±s,n=6)and expression of P-p38MAPK protein in pulmonary arterial walls(±s,n=10)

Tab.3 Western blot analysis of P-p38MAPK expression in lung homogenate(±s,n=6)and expression of P-p38MAPK protein in pulmonary arterial walls(±s,n=10)

N:Normal group;H3d:Hypoxic hypercapnia for 3-day group;H1w:Hypoxic hypercapnia for 1-week group;H2w:Hypoxic hypercapnia for 2-week group;H4w:Hypoxic hypercapnia for 4-week group;HP:PNS-injected group*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs H3dgroup;△P＜0.05 vs H1wgroup;▲P＜0.05 vs H2wgroup;○P＜0.05 vs H4w group

Group P-p38MAPK in lung homogenate P-p38MAPK in pulmonary arterial walls N 0.012±0.006 0.099±0.015 H3d 0.225±0.071* 0.107±0.013 H1w 0.362±0.087*# 0.124±0.025*H2w 0.424±0.061*# 0.151±0.016*#△H4w 0.364±0.071*# 0.150±0.028*#△Hp 0.193±0.044*△▲○ 0.131±0.021*#▲○

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng)和模型復(fù)制的進(jìn)展,大鼠肺動(dòng)脈平均壓和右心指數(shù)呈動(dòng)態(tài)增高,兩周組和4周組均顯著高于正常對(duì)照組,光鏡下顯示肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)彈力板扭曲,中層平滑肌及外膜膠原纖維增生,管腔狹窄,說(shuō)明低O2高CO2肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚模型已建立成功。肺血管重建不但是肺動(dòng)脈高壓持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素,而且是對(duì)血管擴(kuò)張降壓藥物產(chǎn)生抵抗的主要原因。目前認(rèn)為,在低O2、高碳酸等各種刺激因子作用下,肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖以及膠原等細(xì)胞外基質(zhì)在管壁大量沉積是肺動(dòng)脈重建的最主要的原因。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng),(1)大鼠mPAP 1周后即開始明顯升高,4周時(shí)達(dá)到高峰。(2)2周組RV/LV+S即開始明顯升高,4周達(dá)最高水平。(3)2周組、4周組內(nèi)彈力板扭曲明顯,中膜平滑肌細(xì)胞增生,管腔明顯狹窄。說(shuō)明在HHPH形成過(guò)程中出現(xiàn)明顯的肺血管重建。

Kato等[3]研究表明血小板源生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)對(duì)新生內(nèi)膜的VSMC和成熟的中膜VSMC的MAPK激活有相同的作用。Su[4]等發(fā)現(xiàn) ROS通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)了VSMC分化。Viedt等[5]觀察到 ROS調(diào)節(jié)了AngⅡ誘導(dǎo)的JNK和p38MAPK激活,使大鼠VSMCs增殖加快,認(rèn)為表型轉(zhuǎn)化可能與ROS激活了MAPK通路有關(guān)。Kavurma等[6]研究證明不同細(xì)胞亞型的增殖和遷移是MAPK依賴性的,并證明SMC異質(zhì)性至少部分地被特定的MAPK通路所調(diào)節(jié)。我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),(1)肺組織P-p38MAPK水平在1周時(shí)即達(dá)到峰值,且此后一直維持在峰值水平。(2)肺小動(dòng)脈壁P-p38MAPK蛋白吸光度值變化基本同肺組織勻漿Western blot結(jié)果一致;且隨著低O2高CO2進(jìn)展,其主要表達(dá)在肺小動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜,外膜也有少量表達(dá)。這些結(jié)果表明低O2高CO2能夠引起p38MAPK通路的活化;P-p38MAPK在HHPH中呈動(dòng)態(tài)變化;它們的活化參與了肺動(dòng)脈高壓的形成以及肺血管的重建。但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道并不完全一致:孔春初[7]等采用單純低O2復(fù)制大鼠肺動(dòng)脈高壓,P-p38MAPK在正常組和各低氧組肺組織均未見表達(dá),造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的機(jī)理尚不清楚,有可能是高碳酸血癥增強(qiáng)P38 MAPK活化。值得一提的是,P-p38MAPK蛋白在低O2高CO23d時(shí)活性增強(qiáng),在1周達(dá)到高峰后一直保持在高活化狀態(tài)。說(shuō)明低O2高CO2中晚期參與血管重塑的主要通路可能是p38MAPK。Nagata研究[8]發(fā)現(xiàn),p38 MAPK促進(jìn)凋亡或抑制凋亡與p38 MAPK激活的性質(zhì)有關(guān),如短期p38MAPK的激活可引起造血腫瘤細(xì)胞KT6分化,而長(zhǎng)時(shí)間的激活則可促進(jìn)其凋亡;在TNF-α處理的中性粒細(xì)胞中早期p38的激活可延遲凋亡,而晚期p38的激活可加速凋亡。因此,也可以認(rèn)為中晚期p38 MAPK高活化狀態(tài)是一種保護(hù)機(jī)制,以此來(lái)對(duì)抗低O2高CO2引起的肺血管壁增殖重塑。p38 MAPK在HHPH中晚期的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

三七總皂苷(panax notogino side,PNS)具有擴(kuò)張血管、降低血液粘度等多種作用 。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PNS用藥組大鼠與慢性HHPH模型組大鼠相比,平均肺動(dòng)脈壓和右心室重量比都有不同程度的降低,而頸總動(dòng)脈壓無(wú)明顯改變,提示PNS可抑制或預(yù)防慢性HHPH的形成而對(duì)體循環(huán)壓無(wú)明顯影響,即對(duì)HHPH具有選擇性抑制作用。光鏡下Hp組肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)彈力板扭曲明顯減輕,中層平滑肌變薄,WA/TA明顯降低,LA/TA顯著升高。提示PNS具有抑制慢性HHPH大鼠的肺血管結(jié)構(gòu)重建作用。以往研究表明[9],PNS可通過(guò)增加血漿、肺組織中NOS活性和NO含量,增加血漿中T-SOD、Cu/ZnSOD活性,降低紅細(xì)胞比積和減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷而實(shí)現(xiàn)防治慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。周曉霞[10]研究提示 PNS的抗動(dòng)脈硬化作用可能是通過(guò)抑制VSMC異常增殖實(shí)現(xiàn)的。我們的實(shí)驗(yàn)表明,Hp組大鼠肺組織,肺動(dòng)脈壁上的P-p38MAPK蛋白表達(dá)均有下降,同時(shí)Hp組肺血管結(jié)構(gòu)重建較4周組 顯著減輕,說(shuō)明PNS能夠抑制p38MAPK通路活性,從而減輕肺動(dòng)脈高壓的程度。

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