楊麗娜,趙自剛,趙永泉,劉爭(zhēng)杰,牛春雨,張 靜

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,張家口 075000)

研究表明,腸源性細(xì)菌內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑移位至全身是二次打擊、失血性休克導(dǎo)致器官損傷的重要機(jī)制[1,2],腸淋巴液是危重病發(fā)展的橋梁[3,4]。我室以“腸缺血/再灌注”概念為基礎(chǔ),把“夾閉腸系膜淋巴管(mesenteric lymph duct,MLD)阻斷淋巴液回流1 h,再行淋巴液灌注”稱為“腸淋巴再灌注”(mesenteric lymph reperfusion,MLR);發(fā)現(xiàn)單純的MLR對(duì)機(jī)體不造成損害,但可加劇腸系膜上動(dòng)脈閉塞性(superior mesenteric artery occlusion,SMAO)休克這一病理過(guò)程,降低SMAO休克大鼠的平均動(dòng)脈壓及24 h存活率,引起遠(yuǎn)隔多器官功能障礙及組織學(xué)損傷[5],其機(jī)制與MLR加重多個(gè)器官的自由基損傷、一氧化氮釋放、組織細(xì)胞膜泵功能障礙有關(guān)[6]。鑒于腸淋巴途徑作為腸源性內(nèi)毒素移位的關(guān)鍵途徑[7],MLR加劇SMAO休克多器官損傷的作用機(jī)制是否與內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑的移位有關(guān)值得研究。為此,本文觀察MLR對(duì)SMAO休克大鼠多器官內(nèi)毒素(endotoxin,ET)、內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)、炎癥介質(zhì)的影響,揭示腸源性內(nèi)毒素移位在MLR加劇SMAO休克多器官損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠24只,體重280～330 g,購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK[軍]2007-004)。隨機(jī)分為4組(n=6):假手術(shù)組(Sham)、MLR組 、SMAO 組和 SMAO+MLR組。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h,自由飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,動(dòng)物的處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg bw)麻醉大鼠后,剪毛備皮,鋪消毒巾,右股部手術(shù),股動(dòng)脈插管連壓力換能器接生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓,股靜脈給予肝素鈉溶液(1 ml/kg bw,即500 U/kg bw)全身抗凝;行腹部手術(shù),暴露腸系膜根部,游離腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery,SMA),仔細(xì)分離與SMA相伴行的腸系膜淋巴管(mesenteric lymphatic duct,MLD)。在血壓穩(wěn)定10 min后,以無(wú)創(chuàng)血管夾,夾閉MLD根部1 h、松開(kāi)再灌注2 h為MLR組;夾閉SMA根部1 h、松開(kāi)再灌注2 h為SMAO組;同時(shí)夾閉SMA與MLD1 h、松開(kāi)再灌注2 h為SMAO+MLR組;僅分離SMA、MLD,不夾閉者為Sham組。

1.3 取材與標(biāo)本制備

所有動(dòng)物在完成再灌注2 h后(Sham組在相當(dāng)時(shí)間點(diǎn)),立即行腹主動(dòng)脈無(wú)菌取血,置于無(wú)熱源的肝素抗凝管中,3500 r/min,離心15min,取血漿封存于無(wú)熱源玻璃管中,-80℃下冷凍保存。取血后迅速選擇固定位置,無(wú)菌留取肝、腎、肺、心等臟器 0.3～0.5 g組織均分兩份,一份加9倍的無(wú)熱源水,用無(wú)熱源玻璃勻漿器低溫制備組織勻漿,封存于無(wú)熱源玻璃管中,-80℃低溫冰箱(美國(guó)熱電)冷凍保存,用于檢測(cè)內(nèi)毒素含量;另一份加5倍的冷生理鹽水,用高速分散勻質(zhì)機(jī)制備組織勻漿(濃度為16.7%),封存于 EP管中,-80℃下冷凍保存,待測(cè)CD14、LBP、TNF-α含量。

1.4 內(nèi)毒素檢測(cè)(TAL動(dòng)態(tài)濁度法)

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)用檢測(cè)用水稀釋至終濃度為2、0.25、0.03125 EU/ml的等比系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入已復(fù)溶的鱟試劑(TAL)反應(yīng)管中,設(shè)置陰性對(duì)照管與平行管,放入已預(yù)熱至37℃的內(nèi)毒素檢測(cè)儀(ATi 320-06,英國(guó)伯萊金耐特有限公司)的反應(yīng)孔內(nèi),檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm,預(yù)設(shè)限值 92%,得到回歸方程 LgT=2.8369-0.2402LgC(T為反應(yīng)時(shí)間,C為溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素濃度),r=-0.9837,陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間＞3 600 s大于最低濃度的反應(yīng)時(shí)間1664.5 s(圖1)。將待測(cè)樣本70℃水浴10 min,3 000 r/min離心10 min取上清。首先,檢測(cè)不同標(biāo)本從原液到最大有效稀釋倍數(shù)的ET含量,根據(jù)ET回收率,確定各標(biāo)本的最佳有效稀釋倍數(shù)為80倍。其次,根據(jù)稀釋倍數(shù),設(shè)標(biāo)本陽(yáng)性對(duì)照管(加入0.25 EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液)與平行管,應(yīng)用內(nèi)毒素檢測(cè)儀自動(dòng)采集數(shù)據(jù)及分析,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算ET含量。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在生物安全柜(美國(guó)熱電)中進(jìn)行無(wú)熱源操作,所有與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的材料或器具,均去熱源。

Fig.1 Standard curve of endotoxin(ET)

1.5 各器官組織勻漿 LBP、CD14、TNF-α檢測(cè)

酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測(cè)定各器官組織勻漿中LBP、CD14、TNFα含量(試劑盒由美國(guó)R&D公司生產(chǎn)、江蘇希望生物科技有限公司代理),嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作流程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、樣本測(cè)定;終止反應(yīng)后,將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀(Stat Fax-2100型,美國(guó)STAT-FAX公司)槽內(nèi),選擇450 nm光波長(zhǎng)檢測(cè)其OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,計(jì)算各樣本結(jié)果。組織勻漿蛋白定量采用考馬斯亮蘭法(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MLR對(duì)SMAO休克大鼠血漿內(nèi)毒素含量的影響

MLR組血漿ET含量(0.124±0.022 EU/ml)與Sham組(0.115±0.022 EU/ml)比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);與Sham組和MLR組比較,SMAO組(0.317±0.032 EU/ml)及SMAO+MLR組(0.418±0.066 EU/ml)的血漿ET含量均顯著增高(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR組ET水平高于SMAO組(P＜0.05,圖2)。

2.2 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ET含量的影響

MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的ET含量與Sham組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 ET含量均顯著高于Sham組和MLR組(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿ET水平高于SMAO組(P＜0.01,P＜0.05,表1)。

2.3 MLR對(duì)SMAO休克大鼠器官組織勻漿LBP、CD14含量的影響

MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 LBP、CD14含量與Sham組無(wú)明顯差異(P＞0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的LBP、CD14含量均顯著高于Sham組與MLR組(P＜0.01,P＜0.05),且 SMAO+MLR組肝 、肺 、腎 、心肌組織勻漿的CD14水平均顯著高于SMAO組(P＜0.01,P＜0.05,表 2,3)。

Fig.2 Effect of MLR on ET content of plasma in SMAO shock rats(EU/ml, ±s,n=6)

2.4 MLR對(duì)SMAO休克大鼠器官組織勻漿TNF-α含量的影響

MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 TNF-α含量與Sham組無(wú)明顯差異(P＞0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的TNF-α含量均顯著高于Sham組與MLR組(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的TNF-α水平均顯著高于SMAO組(P＜0.01,P＜0.05,表4)。

Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)

Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.240±0.058 0.200±0.016 0.151±0.025 0.292±0.063 MLR 0.373±0.049 0.244±0.035 0.188±0.040 0.381±0.082 SMAO 0.645±0.059**## 0.662±0.044**## 0.494±0.083**## 0.595±0.090**#SMAO+MLR 0.728±0.088**##△ 0.892±0.154**##△△ 0.585±0.072**##△ 0.746±0.142**##△

Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)

Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 1.008±0.123 3.299±0.443 1.237±0.250 1.739±0.463 MLR 1.180±0.093 3.206±0.465 1.355±0.290 1.851±0.385 SMAO 1.521±0.346*# 3.926±0.214*# 1.572±0.453**## 2.794±0.541**##SMAO+MLR 1.921±0.265**##△ 4.223±0.465**##△ 2.182±0.519**##△△ 3.040±0.474**##△

Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)

Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.964±0.079 0.812±0.183 0.387±0.082 0.538±0.066 MLR 1.058±0.164 0.831±0.195 0.444±0.093 0.668±0.033 SMAO 1.389±0.145*# 1.089±0.174*# 0.740±0.080*# 1.011±0.196**#SMAO+MLR 1.661±0.100**##△ 1.329±0.079**##△ 0.871±0.120**##△ 1.348±0.180**##△△

Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)

Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 27.90±5.47 36.33±6.54 21.05±3.41 26.58±7.32 MLR 28.05±4.56 38.85±7.90 22.41±4.77 28.87±5.69 SMAO 35.50±5.76*# 48.98±2.50*# 26.68±4.80*# 136.31±7.14**##SMAO+MLR 41.34±8.80**##△△ 56.28±9.27**##△△ 29.98±6.91**##△ 42.84±7.03**##△△

3 討論

炎癥介質(zhì)大量釋放引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是多種致病因素導(dǎo)致多器官損傷甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的關(guān)鍵環(huán)節(jié);內(nèi)毒素移位至遠(yuǎn)隔器官刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生并釋放大量的炎癥介質(zhì)是機(jī)體炎癥反應(yīng)失控的主要因素之一[8]。為此,本文從內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑移位的角度,探討MLR加重SMAO休克大鼠多個(gè)器官損傷的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn),SMAO休克組大鼠血漿以及肝、肺、心、腎等組織中ET的水平顯著增高,提示SMAO休克后器官損傷的機(jī)制與內(nèi)毒素移位有關(guān),其主要機(jī)制為缺血1 h引起腸粘膜缺血性損傷、再灌注2 h引起腸粘膜的再灌注損傷導(dǎo)致了腸屏障功能障礙,繼而引起了腸源性內(nèi)毒素移位,導(dǎo)致血漿以及遠(yuǎn)隔器官中ET水平提高。而行MLD與SMA同時(shí)夾閉1 h恢復(fù)再灌2 h的SMAO+MLR組大鼠血漿與肝、肺、心、腎組織勻漿的ET水平高于SMAO組,說(shuō)明MLR加重了SMAO休克大鼠內(nèi)毒素移位的程度,其作用機(jī)制與ET經(jīng)腸淋巴途徑移位增多有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從ET角度證實(shí)了MLR加重SMAO休克的作用機(jī)制與腸源性內(nèi)毒素移位有關(guān),其機(jī)制可能與SMAO狀態(tài)下MLR引起了腸系膜微淋巴管損傷、腸源性內(nèi)毒素通過(guò)腸系膜微淋巴管吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)增多有關(guān)。

研究表明,LPS不僅直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞,而且還與LBP相結(jié)合形成LPS-LBP復(fù)合物,在LBP運(yùn)載下與單核巨噬細(xì)胞表面的CD14結(jié)合,激活免疫細(xì)胞,產(chǎn)生炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子,促進(jìn)組織損傷,可見(jiàn),LBP和CD14這一組蛋白與內(nèi)毒素引起炎癥介質(zhì)釋放的作用機(jī)制關(guān)系密切[9]。同時(shí),LBP的存在使LPS刺激合成炎癥介質(zhì)TNF-α的閾值下降,并使LPS誘導(dǎo)激活巨噬細(xì)胞生成細(xì)胞因子的速度較LPS單獨(dú)作用時(shí)迅速增加,而抗LBP抗體可明顯抑制LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力;CD14可增強(qiáng)CD14+細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性;CD14-細(xì)胞在轉(zhuǎn)染CD14后對(duì)LPS的反應(yīng)性可增強(qiáng)1000倍;可見(jiàn) LBP/CD14不僅是LPS引起損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子,而且具有顯著的LPS增敏效應(yīng),LBP/CD14系統(tǒng)也被稱作內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)[10]。本文通過(guò)檢測(cè) LBP、CD14、TNF-α的研究發(fā)現(xiàn),SMAO休克組大鼠肝、肺、心、腎等組織LBP、CD14的含量均顯著升高,成為L(zhǎng)PS引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),增高的TNF-α則是內(nèi)毒素移位、LBP/CD14增加LPS作用的結(jié)果;SMAO+MLR組大鼠肝、肺、心、腎組織勻漿 LBP、CD14的含量顯著高于SMAO組,提示MLR增加了SMAO休克大鼠內(nèi)毒素致敏系統(tǒng)的活性,這也是最終引起炎癥介質(zhì)TNF-α釋放增多、加重組織器官炎癥反應(yīng)與損傷的重要機(jī)制。

綜上,MLR增加了SMAO休克大鼠腸源性ET經(jīng)腸淋巴途徑移位至遠(yuǎn)隔器官,同時(shí)激活LBP/CD14系統(tǒng),提高器官組織對(duì)腸源性ET的敏感性,誘導(dǎo)產(chǎn)生并釋放TNF-α等炎癥介質(zhì),加重炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)與器官損傷,腸源性內(nèi)毒素移位在MLR加劇SMAO休克多器官功能障礙的發(fā)病學(xué)中具有重要的作用。研究結(jié)果也提示,通過(guò)對(duì)LPS-LBP/CD14系統(tǒng)及腸淋巴途徑的干預(yù),可減輕SMAO休克的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),這對(duì)于防治器官損傷具有一定的參考價(jià)值及指導(dǎo)意義。

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