汪建中，陳 鵬，何宏玉

（1.江西省人民醫(yī)院口腔科；2.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部a.2009級；b.2010級，南昌 330006）

目前，高速手機(jī)車針是臨床日常切割牙體硬組織的工具，由于車針的震動、噪音、產(chǎn)熱等因素易使患者產(chǎn)生酸痛、恐懼等癥狀。因此，尋求一種新的更好的切割工具是口腔醫(yī)學(xué)界一直以來在探索的問題。Er:YAG激光作為一種性能優(yōu)良的切割牙體硬組織激光現(xiàn)已成為關(guān)注的熱點(diǎn)，本文分別采用Er：YAG激光與車針對兔牙備洞，觀察、比較2種方法對兔牙髓組織的影響，旨在為臨床應(yīng)用Er：YAG激光備牙提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

日本大耳白兔48只，雄性，3月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供。

1.2 主要試劑和儀器

HSP70單克隆抗體、SABC免疫組化染色、試劑盒及DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），HANS-MDWL6激光治療機(jī)（中國大族激光科技股份有限公司）、PANA-MAX高速手機(jī)（日本NSK集團(tuán)有限公司）、RM2135徠卡組織切片機(jī)（德國LETCA儀器有限公司）、BX40F4奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組

將48只日本大耳白兔隨機(jī)分為3組：對照組（A 組）、Er:YAG 激光組（B 組）和車針組（C 組），每組16只。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物模型建立

B組：3%戌巴比妥鈉兔耳緣靜脈注射麻醉（30 mg·kg-1），用Er:YAG激光對兔下頜右側(cè)中切牙牙冠唇面頸1/3中點(diǎn)處行直徑2 mm、深0.5 mm的窩洞制備，采用波長 2 940 nm，功率 6 W，水∶氣＝1∶1，光斑直徑為2 mm的Er:YAG激光治療機(jī)，激光束距牙表面1 mm連續(xù)射擊10 s備洞。備洞后即刻用玻璃離子（富士Ⅱ）充填。

C組：麻醉同B組前，選擇直徑2 mm的柱狀金鋼砂標(biāo)記車針對兔下頜右側(cè)中切牙牙冠唇面頸1/3中點(diǎn)處行直徑2 mm、深0.5 mm的窩洞制備。備洞時(shí)間控制在10 s內(nèi)，備洞后即刻用玻璃離子（富士Ⅱ）充填。

A組：不做任何處理。

1.3.3 標(biāo)本和組織切片制備

3組分別在備洞后24 h、3 d、7d和14 d時(shí)各處死4只兔，取出實(shí)驗(yàn)牙，立即置于10%福爾馬林溶液內(nèi)，室溫下固定24 h，去除舌側(cè)牙體硬組織完整取出牙髓，梯度酒精脫水，石蠟包埋，行5 μm厚的連續(xù)縱切片（沿長軸），取標(biāo)本縱載面積較大的切片2張，置于40℃水溶中，一張常規(guī)HE染色低倍（×100）光鏡觀察，另一張待做免疫組化染色（ICH）。

1.3.4 ICH誘導(dǎo)型HSP70測定

按ICH、顯色試劑盒的操作要求對切片進(jìn)行染色、顯色，在高倍（×400）光鏡下，采用雙盲法閱片，每張切片中央?yún)^(qū)與4個邊緣區(qū)隨機(jī)選取5個視野觀察誘導(dǎo)型HSP70的陽性表達(dá)。

1.3.5 ICH結(jié)果的判定

牙髓組織細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色定為誘導(dǎo)型HSP70陽性，根據(jù)染色程度可將ICH結(jié)果分為4級：細(xì)胞內(nèi)無染色為陰性（－），淡黃色為弱陽性（+），棕黃色為中度陽性（），棕褐色為強(qiáng)陽性（）。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

A組：各時(shí)間點(diǎn)牙髓組織無異常，無炎癥表現(xiàn)。

B組：激光備洞后24 h時(shí)出現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列輕度紊亂，血管輕度擴(kuò)張，髓腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞；3 d時(shí)有部分成纖維細(xì)胞增生，血管輕度擴(kuò)張，較多的炎癥細(xì)胞浸潤；7 d時(shí)可見成牙本質(zhì)細(xì)胞重新排列，已無血管擴(kuò)張表現(xiàn)，少許的炎癥細(xì)胞浸潤；14 d時(shí)牙髓成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列整齊，成纖維細(xì)胞分布均勻，血管恢復(fù)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤。

C組：車針備洞后24 h時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列紊亂，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，血管擴(kuò)張充血，有較多的炎癥細(xì)胞浸潤；3 d時(shí)成纖維細(xì)胞增生、分化，有明顯的血管擴(kuò)張充血，可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤；7 d時(shí)成纖維細(xì)胞呈環(huán)狀排列，較多炎癥細(xì)胞浸潤；14 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞重新排列，血管基本恢復(fù)正常，少許的炎癥細(xì)胞浸潤。

2.2 ICH誘導(dǎo)型HSP70表達(dá)結(jié)果

A組：各時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)型HSP70表達(dá)陰性（－），見封四圖1A。

B組：24 h時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)淡黃色的弱陽性（+）表達(dá)，血管壁平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞可見棕黃色的中度陽性（）表達(dá)。3 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管壁平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞為棕黃色的中度陽性（）表達(dá)，見封四圖1B。7 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管壁平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞為淡黃色的弱陽性（+）表達(dá)。14 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管壁平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞呈陰性（－）表達(dá)。

C組：24 h時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞呈棕黃色的中度（）表達(dá)，血管壁平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞可見棕褐色強(qiáng)陽性表達(dá)。3 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管壁平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均呈現(xiàn)棕褐色強(qiáng)陽性（）表達(dá)，見封四圖1C。7 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均表現(xiàn)為棕黃色中度陽性（）表達(dá)。14 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均呈現(xiàn)淡黃色弱陽性（+）表達(dá)。

3 討論

HSP70由2種同源體構(gòu)成：結(jié)構(gòu)型HSP70（HSC70）和誘導(dǎo)型HSP70（HSP70），正常生長的細(xì)胞中本身就含有結(jié)構(gòu)型HSP70，即HSC70，但誘導(dǎo)型HSP70，即HSP70僅熱休克后才出現(xiàn)于細(xì)胞中[1]。本實(shí)驗(yàn)檢測的是誘導(dǎo)型HSP70，因此，對照組（A組）牙髓組織細(xì)胞中HSP70呈陰性表達(dá)。

N.Bhardwaj等[2]研究表明當(dāng)機(jī)體細(xì)胞在受到有害刺激時(shí)，HSP70表達(dá)就會增加，從而提高細(xì)胞對刺激原的耐受程度，并且作為分子伴侶，HSP70參與蛋白質(zhì)的合成與降解，維持酶的動力學(xué)特征，以維護(hù)細(xì)胞正常功能。此外，HSP70還在細(xì)胞抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程中起關(guān)鍵作用。有學(xué)者[3]研究發(fā)現(xiàn)，不良刺激會使機(jī)體產(chǎn)生各種炎性細(xì)胞因子（IL21、IL22等）及氧自由基的含量增加，與此同時(shí)，亦伴有HSP70的大量產(chǎn)生來對抗細(xì)胞因子及氧自由基對細(xì)胞的損害作用，抑制IL21、IL22的生成并加快氧自由基的消除。C.Kitamura等[4]在研究調(diào)節(jié)牙髓細(xì)胞凋亡的JNK通路時(shí)發(fā)現(xiàn)，HSP70的過表達(dá)可對JNK激酶產(chǎn)生明顯的抑制作用，從而阻斷JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，HSP70可作為評價(jià)應(yīng)激傷害反應(yīng)的重要指標(biāo)。

在車針備洞（C組）過程中，器械切割牙體硬組織會不可避免地產(chǎn)熱刺激牙髓組織細(xì)胞，而且切割過程中會出現(xiàn)牙本質(zhì)小管暴露，牙本質(zhì)小管液因壓力倒流入髓腔[5]，同時(shí)，有熱量隨牙本質(zhì)小管液傳遞到牙髓組織內(nèi)使髓腔內(nèi)溫度升高。這種熱刺激不但可以引起炎癥反應(yīng)，而且牙髓組織細(xì)胞中HSP70也會大量表達(dá)，因此，本實(shí)驗(yàn)中可見車針備洞后24 h成本質(zhì)細(xì)胞層排列紊亂，血管擴(kuò)張充血，并有炎性細(xì)胞浸潤，HSP70中強(qiáng)度陽性表達(dá)。3 d時(shí)炎癥反應(yīng)更加明顯，HSP70強(qiáng)陽性表達(dá)，而后炎癥逐漸減弱，HSP70陽性表達(dá)下降。14 d時(shí)炎癥基本消失，HSP70呈弱陽性表達(dá)。

在Er：YAG激光備洞組（B組）中，在各時(shí)間點(diǎn)牙髓組織炎癥表現(xiàn)及HSP70陽性表達(dá)都明顯低于同時(shí)期的車針備洞（C組）。這可能與激光切割牙體硬組織的原理有關(guān)。Er：YAG激光照射的能量被水霧和牙體硬組織的水分子吸收后，發(fā)生一系列的微爆裂和汽化作用，導(dǎo)致鈣化組織表面發(fā)生碎裂而達(dá)到切割的目的[6]。這與車針備洞的機(jī)械切割產(chǎn)熱不同，Er：YAG激光切割過程中激光的大部分能量被水吸收轉(zhuǎn)化為動能，產(chǎn)熱較少，對深層組織不會造成熱損傷[7]，所以 Er：YAG 激光組所受的熱刺激要明顯小于車針組。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，Er：YAG激光備洞組（B組）HSP70表達(dá)強(qiáng)度減弱的速度要明顯快于車針備洞組（C組）。這可能有2個原因：一是B組的刺激及炎癥反應(yīng)較輕，HSP70陽性表達(dá)一直低于C組，在應(yīng)激反應(yīng)末期能更快地恢復(fù)到正常；二是B組牙髓細(xì)胞的修復(fù)速度大于C組。

總之，Er：YAG激光備洞對兔牙髓組織的影響明顯小于車針備洞，且Er：YAG激光備洞后兔牙髓組織的恢復(fù)速度明顯快于車針備洞，提示Er：YAG激光用于臨床切割牙體硬組織有著很好的前景。

[1] 劉曉亮.熱休克蛋白在口腔疾病中的作用[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2000，10（2）：109-110.

[2] Bhardwaj N,Dormer J,Ahmad F,et al.Heat shock protion 70 expression following hepatic radiofrequency ablation is affectedbyadjacentvasculature [J].SurgRes，2010，10（23）：45-48.

[3] Didelot C,Schmitt E,Brunet M,et al.Heat shock proteins:endogenous modulators of apoptotic cell death [J].Handb Exp Pharmacol，2006，1（72）：171-198.

[4] Kitamura C,Ogawa Y,Nishihara T,et al.Transient colocalization of c-Jun N-terminal Kinase and c-Jun with heat shock protein 70 in pulp cells during apoptosis[J].Dent Res,2003，82（2）：91-95.

[5] Camps J,Dejou J,Remusat M,et al.Influencing pulpal response to cavity restorations[J].Dent Mater，2000，16（6）：432-440.

[6] Bolortuya G，Ebihara A，Ichinose S，et al.Effects of den-tin surface modifications treated with Er：YAG and Nd：YAG laser irradiation on fibroblast cell adhesion[J].Photomed Laser Sury，2012，30（2）：63-70.

[7] Contente M，Lima F，Galo R，et al.Temperature rise during Er：YAG cavity preparation of primary enamel[J].Laser Med Sci，2012，27（1）：1-5.