鄭 鵬，于 磊，田亞光，黃 賀，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雄性生殖干細胞具有自我復(fù)制和分化成精子的能力，是動物體內(nèi)唯一能進行遺傳信息傳遞的干細胞。雄性生殖干細胞既是干細胞生物學(xué)的重要研究對象，又是研究精子發(fā)生、制作轉(zhuǎn)基因動物和研究基因功能的重要資源。Brinter等報道，將可育小鼠的雄性生殖干細胞移植到不育小鼠的睪丸中并建立精子發(fā)生[1]，雄性生殖干細胞成為干細胞研究領(lǐng)域的研究熱點。然而，雄性生殖干細胞的體外長期培養(yǎng)卻未獲得成功。直到Kanatsu-Shinohar等和Kubota等先后報道了小鼠的雄性生殖干細胞的體外長期培養(yǎng)和增殖的成熟體系[2]。生殖干細胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將為克隆動物[2]、保護瀕危物種[3]、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物[4]、治療雄性不育以及一些人類遺傳疾病的基因治療[5]提供新的機遇與途徑。最近的研究表明，雄性生殖干細胞可以誘導(dǎo)分化成特定類型的細胞[6-8]，在再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，是繼ES細胞、iPS細胞之后的另一種細胞來源。在牛ES細胞、iPS細胞沒有成功建立之前，進行牛雄性生殖干細胞體外培養(yǎng)，研究牛雄性生殖干細胞的多能性，闡述細胞重編程的重要基礎(chǔ)理論具有重要意義。

目前，關(guān)于哺乳動物雄性生殖干細胞體外增殖與分化研究主要集中在小鼠和人，其他動物的研究很少。有關(guān)牛雄性生殖干細胞的研究主要是集中在對4～6月齡牛雄性生殖干細胞的分離純化[9-11]、冷凍保存[12]、自體移植[13]、異體移植[14]、體外分化培養(yǎng)[15]等。本文對新生牛雄性生殖干細胞進行分離純化，對其培養(yǎng)、鑒定，探討新生牛睪丸雄性生殖干細胞體外增殖相關(guān)影響因素和技術(shù)體系，以期為建立穩(wěn)定、高效的家畜雄性生殖干細胞體外增殖與分化體系提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品

新生牛睪丸采自出生后未超過24 h健康的荷斯坦公牛（哈爾濱市現(xiàn)代生物科技有限公司提供）。無菌操作取出雙側(cè)睪丸，置于4℃生理鹽水中，2 h內(nèi)送回實驗室。

實驗所用試劑除DMEM/F-12、FBS(購自Gibco公司)外，其他無特殊說明外（均購自Sigma公司）；實驗所用抗體（購自Santa cruz公司）；RNA提取試劑盒（購自Solarbio）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自ABI）；Taq酶等（均購自大連寶生物公司）；雄性生殖干細胞培養(yǎng)基：DMEM/F-12+2%（或10%）血清+2 mmol·L-1-谷氨酰胺+0.1 mmol·L-1巰基乙醇+1%雙抗+1%MEM非必需氨基酸溶液+1%MEM維生素溶液+10 μg·mL-1胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉+30 μg·mL-1丙酮酸鈉。

1.2 方法

1.2.1 生殖干細胞的分離純化

參照文獻[16]的方法制備生精細胞懸液，并采用差速貼壁法和不連續(xù)密度梯度Percoll分選法分離純化生殖干細胞和支持細胞。

差速貼壁分選采用6種方法：分別是含10%血清的培養(yǎng)液、培養(yǎng)2～4 h后差速、過夜培養(yǎng)、進行兩步法差速（A）；含2%血清的培養(yǎng)液、培養(yǎng)2～4 h后差速、過夜培養(yǎng)、進行兩步法差速（B）；含2%血清的培養(yǎng)液、直接培養(yǎng)過夜、進行一步法差速（C）；用明膠包被培養(yǎng)瓶，按照上述三種方法（A、B、C）進行差速（A+、B+、C+）。分別在差速前（0 h）、培養(yǎng)2～4 h后差速后、過夜培養(yǎng)差速后進行AKP染色，鑒定生殖干細胞的比例。

參照文獻[17-18]的方法進行生精細胞的不連續(xù)密度梯度Percoll分選，Percoll分選法分別采用20%、30%、40%、50%、60%的Percoll液進行分選。分選的各層細胞分別用臺盼藍進行死活染色、AKP進行生殖干細胞的比例鑒定。

生精細胞懸液進行不連續(xù)密度梯度Percoll分選后，采用A種方法，進行兩次差速貼壁分選。分選后用進行AKP染色，鑒定生殖干細胞的比例。

1.2.2 生殖干細胞的培養(yǎng)

將純化的雄性生殖干細胞以1×104個·cm-2的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中（Coing），于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別為含2%和10%濃度血清的培養(yǎng)液，檢測血清濃度對生殖干細胞和支持細胞增殖的影響。在2%血清濃度的培養(yǎng)液中添加100 ng的GDNF培養(yǎng)雄性生殖干細胞，觀察生殖干細胞的增殖并進行AKP和OCT-4免疫組化染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 差速貼壁分選的比較

差速貼壁分選的結(jié)果見表1，明膠包被培養(yǎng)瓶的方法，并沒有顯著提高生殖干細胞的比例（P＞0.05）；培養(yǎng)2～4 h后差速，10%的血清培養(yǎng)液組的細胞AKP陽性率顯著高于2%的血清培養(yǎng)液組（P＜0.05）；過夜培養(yǎng)后，六種方法之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不連續(xù)密度梯度分選

生殖干細胞懸液梯度分選后，形成兩條帶和最底層的血細胞。第一條帶的細胞離心洗滌后，利用臺盼藍染色，顯示大部分是死細胞，進行培養(yǎng)時細胞沒有貼壁。第二條帶的細胞離心洗滌后，利用臺盼藍染色，顯示95%以上都是活細胞，利用AKP進行染色，顯示雄性生殖干細胞的比例在7%左右（見表2）。

2.3 差速貼壁分選與不連續(xù)密度梯度分選的比較

梯度分選后，繼續(xù)進行兩次差速貼壁，并與單純的差速貼壁、梯度分選進行比較，結(jié)果顯示（見表2），不連續(xù)密度梯度分選能有效的去除細胞碎屑和血細胞，但同時也會損失一些雄性生殖干細胞和支持細胞（回收細胞數(shù)6.1×106＜細胞總數(shù)107），回收的雄性生殖干細胞數(shù)與不連續(xù)密度梯度后進行差速貼壁分選之間差異不顯著。差速貼壁分選的回收細胞數(shù)、回收的雄性生殖干細胞數(shù)顯著高于不連續(xù)密度梯度后進行差速貼壁分選，二者的細胞AKP陽性率之間差異不顯著。三種方法的細胞活率之間差異不顯著?？梢姡贿B續(xù)密度梯度分選的作用主要在于除去血細胞和細胞碎屑的影響。

表1 雄性生殖干細胞差速貼壁分選比較（AKP陽性率,%）（n=10）Table 1 Comparison of differential adhesion methods of male germline stem cells(AKP positive rates,%,n=10)

表2 差速貼壁與梯度分選的比較（n=10）Table 2 Comparison of differential adhesion and gradient sorting method

2.4 不同培養(yǎng)液的比較

2.4.1 血清對雄性生殖干細胞增殖的影響

將分離純化后的雄性生殖干細胞懸液以1×104個·mL-1的密度接種到培養(yǎng)板內(nèi)，檢測血清濃度對細胞增殖的影響。雄性生殖干細胞進行緩慢的增殖，并且在培養(yǎng)的0～7 d內(nèi)，10%培養(yǎng)液中的增殖速度稍大于2%培養(yǎng)液中的增殖速度，但差異并不顯著（P＞0.05），在培養(yǎng)10 d時，10%培養(yǎng)液中雄性生殖干細胞數(shù)量小于2%培養(yǎng)液中雄性生殖干細胞數(shù)量，差異也不顯著（P＞0.05）（見表3）。

表3 血清對雄性生殖干細胞增殖的影響（×104）（n=5）Table 3 Impact of serum to male germline stem cells proliferation(×104,n=5)

2.4.2 血清對支持細胞增殖的影響

支持細胞增殖速度較快，并且在培養(yǎng)的7～10d時，10%培養(yǎng)液中增殖速度大于2%培養(yǎng)液中的增殖速度，且二者之間差異顯著（P＜0.05）（見表4）。

表4 血清對支持細胞增殖的影響（×104,n=5）Table 4 Impact of serum to sertoli cells proliferation （×104,n=5）

在2%和10%血清濃度的培養(yǎng)液中雄性生殖干細胞增殖速度相近，而10%血清濃度的培養(yǎng)液中支持細胞增殖較快（見圖1），由于競爭營養(yǎng)和生長空間，不利于雄性生殖干細胞增殖。因此，本試驗在原代培養(yǎng)時，使用2%血清濃度的培養(yǎng)液。

圖1 血清濃度對細胞增殖的影響Fig.1 Impact of different serum concentrations to cell proliferation

2.5 雄性生殖干細胞的培養(yǎng)與鑒定

將分離純化后的雄性生殖干細胞懸液以1×104個·mL-1的密度接種到培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，添加100 ng的GDNF能顯著促進雄性生殖干細胞增殖（見表5）。增殖的雄性生殖干細胞集落進行AKP、OCT-4染色，集落呈陽性表達結(jié)果見圖版Ⅰ、Ⅱ（圖版Ⅱ彩版見封二），初步確定雄性生殖干細胞集落具有一定的多能性。

表5 GDNF對雄性生殖干細胞增殖的影響（×104,n=5）Table 5 Impact of GDNF to male germline stem cells proliferation （×104,n=5）

圖版Ⅰ 培養(yǎng)3 d的雄性生殖干細胞的AKP染色PlateⅠ AKP staining of male germline stem cells after 3 d cultured,Bar=100 μm

圖版Ⅱ 雄性生殖干細胞的OCT-4染色PlateⅡ OCT-4 staining of male germline stem cells

3 討論與結(jié)論

3.1 生殖干細胞的分離與純化

生精上皮細胞的分離多采用膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶、DNA酶組合法消化，不同的實驗室根據(jù)需要采用不同的組合。其關(guān)鍵在于控制消化程度，若消化不足，則管周肌樣細胞殘余較多；消化過度，則生精上皮細胞大量丟失或受損，嚴重影響細胞產(chǎn)量及活率。本試驗先采用膠原酶處理，獲得較純凈的曲細精管，然后以胰酶消化曲細精管獲得生精上皮細胞。生精細胞懸液中常常并不能完全徹底地分離出目的細胞，只能達到培養(yǎng)物中以某種細胞為主的程度，所以也常稱為富集（Enrichment）。分離純化的方法主要有：不連續(xù)Percoll密度梯度離心法[17-18]、差速貼壁分選法[19]、流式細胞分選法[19-20]以及免疫磁珠分離法[6,20]等。本試驗應(yīng)用差速貼壁法、不連續(xù)密度梯度Percoll分選法分選生殖干細胞和支持細胞，結(jié)果顯示不連續(xù)密度梯度分選能有效的去除細胞碎屑和血細胞，同時也會損失一些雄性生殖干細胞和支持細胞，綜合考慮，差速貼壁分選法與其他方法相比更加簡單、可行。

3.2 生殖干細胞的培養(yǎng)與多能性

目前，精原干細胞體外培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基種類較多，添加成分各異，一般采用DMEM/F-12為基本培養(yǎng)基。Izadyar等研究認為牛精原細胞在MEM中培養(yǎng)比在KSOM中培養(yǎng)增殖更快[10]。Kubota等比較α-MEM和F12對小鼠精原細胞體外無血清培養(yǎng)的效果，結(jié)果表明α-MEM效果較好，顯示不同動物來源的精原細胞需要采用不同的培養(yǎng)系統(tǒng)[20]。

當前關(guān)于精原干細胞培養(yǎng)條件的相關(guān)報道中絕大多數(shù)都添加一定量的血清。有研究表明，培養(yǎng)不同動物精原干細胞，培養(yǎng)基中所添加的血清濃度是不同的，對于牛精原細胞在無血清的條件下，培養(yǎng)幾天后精原細胞大量死亡；加入2.5%血清時，精原細胞的存活和增殖情況有明顯改善；加入更高濃度血清時，雖然精原細胞數(shù)目增加，但支持細胞和間質(zhì)細胞的增殖遠大于精原細胞[10]。因此，適宜的血清濃度可以延長精原細胞體外存活時間。膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的一個成員。體外試驗研究顯示，培養(yǎng)液中添加GDNF影響多種動物精原干細胞的增殖，Shinohara等[19]試圖建立小鼠精原細胞的無血清或無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，但結(jié)果顯示在無飼養(yǎng)層和GDNF存在時，精原細胞不能增殖。大多數(shù)關(guān)于精原干細胞培養(yǎng)的報道均表明，GDNF是調(diào)節(jié)精原干細胞增殖、分裂的關(guān)鍵因素之一[15]。在本試驗中，采用2%血清，添加GDNF的培養(yǎng)液培養(yǎng)生殖干細胞，能顯著促進雄性生殖干細胞增殖。

AKP（Alkaline phosphatase）在胚胎干細胞和成體干細胞中的活性很高，干細胞一旦分化，則AKP呈陰性。AKP常用來作為鑒定干細胞特性的標志[21]。OCT-4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，由pou5f1基因編碼，在早期胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，所表達的蛋白質(zhì)是細胞全能性的重要標志，OCT-4是參與調(diào)控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時也是體外建立誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）的關(guān)鍵基因[22]。OCT-4在ESC、PGCs、精原干細胞中都存在表達[23]，并且用來鑒定細胞是處于自我更新、維持未分化的多能性狀態(tài)，還是進入分化狀態(tài)、失去多能性。因此，試驗中應(yīng)用AKP和OCT-4鑒定精原干細胞，證實新生牛睪丸中精原干細胞具有多能性，培養(yǎng)后形成的集落也具有多能性，本研究進一步證實了Simon等關(guān)于精原干細胞本身就具有多能性，可以直接轉(zhuǎn)化為體細胞的觀點[8]。

3.3 雄性生殖干細胞

雄性生殖干細胞作為體內(nèi)位置確定、終身存在，并且能將攜帶的遺傳信息傳遞至下一代的成體干細胞，在干細胞研究中的優(yōu)勢是顯而易見的：更方便用于轉(zhuǎn)基因動物的研究、更方便簡單地分化成多能干細胞、為男性不育治療提供新途徑等等。但是，雄性生殖干細胞的體外增殖和分化一直困擾著生殖干細胞的發(fā)展進步，雖然在嚙齒類動物上完成了生殖干細胞的長期培養(yǎng)鑒定，但是體外生殖干細胞分化成有活性、有受精能力的可育精子一直沒有突破，大大限制了雄性生殖干細胞的應(yīng)用和發(fā)展。

本試驗對新生牛雄性生殖干細胞分離純化的方法進行研究，并進行培養(yǎng)、鑒定，初步建立了新生牛睪丸雄性生殖干細胞的分離純化與體外培養(yǎng)技術(shù)體系，將為建立穩(wěn)定、高效的家畜雄性生殖干細胞體外增殖與分化體系提供理論和實踐依據(jù)。

差速壁法能有效分選雄性生殖干細胞與支持細胞，2%血清培養(yǎng)液可用于雄性生殖干細胞體外培養(yǎng)，且培養(yǎng)基中添加GDNF能顯著促進雄性生殖干細胞的增殖，增殖形成的雄性生殖干細胞集落具有多能性。

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