李雅娟，高 敏，錢 聰，曹頂臣，孫效文

（1.大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070）

德國鏡鯉(Cyprinus carpioL.mirror)具有生長速度快、含肉率高、肉質好、易捕撈等優(yōu)點，它與黑龍江野鯉、紅鯉等雜交，其雜種后代都表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢[1]。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）是我國常見的一種小型經濟魚類。泥鰍肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質及多種維生素，并具有藥用價值[2]。泥鰍存在多倍體現(xiàn)象，我國除了二倍體泥鰍外還存在天然三倍體、四倍體泥鰍[3-7]。最近Li等研究表明，我國自然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體，是多倍體育種的良好材料[8-9]。核仁組織區(qū)(Nucleolus organizer region，NOR)是真核細胞染色體上18s+28s r RNA基因所在的部位，是生產rRNA的場所。用硝酸銀染色法可顯示有活性的Ag-NOR。NOR數(shù)目被認為是一個穩(wěn)定的細胞遺傳學指標。用攜帶有Ag-NORs的染色體作為魚類核型進化的指標，對于探討魚類系統(tǒng)發(fā)生具有重要意義。這種方法已在哺乳類和兩棲類等脊椎動物獲得廣泛應用。自Klingerman等最早對魚類NOR進行分析以來，這方面的研究逐漸增多[10]。據(jù)不完全統(tǒng)計，迄今已對200余種魚的染色體NOR進行了分析。國內對于魚類銀染帶的研究起步比較晚，中國具有世界上最為豐富的鯉科魚類[11]，關于鯉科魚染色體核仁組織區(qū)(NOR)研究也曾有報道。桂建芳等對四種鯉科魚類的銀染核型進行了研究[12]。王蕊芳等對鯉魚的一些品種的染色體銀染帶及不同地理區(qū)域鯽魚染色體銀染核仁組織者的進行了比較研究[14]。任修海等對36種鯉科魚染色體核仁組織區(qū)(NOR)研究指出，中國鯉科魚類NOR的基本特征是，2對NOR存在于亞中部著絲粒染色體上，屬于較特化的類型[15]。楊太有等對黃河鯉的染色體核型及銀染核型進行了研究[16]。鯉科魚類的倍性問題一直是科學家的研究熱點，據(jù)報道德國鏡鯉染色體數(shù)目為100[17]，它是具有4套染色體組的遺傳的四倍體（4n=100），還是已經二倍化的進化的四倍體（2n=100），目前尚未清楚。因此，本文通過對德國鏡鯉與二倍體泥鰍、四倍體泥鰍的銀染核型進行比較分析，旨在為德國鏡鯉和泥鰍的起源提供細胞遺傳學證據(jù)，并為其遺傳、變異、分類、系統(tǒng)演化以及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚的采集

德國鏡鯉采自黑龍江省呼蘭永興魚場（雌魚22尾，雄魚10尾），暫養(yǎng)于實驗室水族箱，暫養(yǎng)溫度為（22±2）℃。泥鰍采自長江水系湖北省赤壁市，運回實驗室暫養(yǎng)，暫養(yǎng)溫度（23±1）℃。

1.2 染色體標本的制備

每尾魚腹腔注射PHA溶液，劑量為6 μg·g-1（魚體重），18～20 h后進行第二次注射PHA（劑量同第一次），作用4～6 h后，活體腹腔注射0.1%秋水仙素，劑量為6 μg·g-1（魚體重），作用2～3 h。剪尾鰭放血5～10 min。分別取鰓、腎組織剪成小塊，置于0.8%的檸檬酸鈉溶液中，室溫低滲40～45 min。再將鰓、腎組織塊移入新配制預冷的卡諾固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)中，每隔15 min更換一次固定液，重復3次。加入新的固定液置-20℃冰箱中過夜保存，次日取部分組織塊用50%冰醋酸解離，剪成細胞懸液，加入新配置卡諾固定液，過濾。采用冷滴片法制備染色體標本。

1.3 銀染（Ag-NOR）

采用Howell和Black[18]的快速銀染法。50%硝酸銀與2%明膠（內含1%甲酸）以2∶1混勻后滴在染色體標本上，加蓋玻片，70℃處理2 min。當整張玻片呈棕黃色時取出，流水沖去蓋玻片，干燥后鏡檢。

1.4 核型分析方法

分別觀察50個分裂相和100個細胞核，以確定Ag-NORs的數(shù)目。選取3～5個清晰、分散較好的分裂相進行顯微拍照，并分別進行染色體計數(shù)。核型分析參照文獻[19]的方法進行，以確定Ag-NORs的位置。

2 結果與分析

2.1 Ag-NORs的數(shù)目

Ag-NORs的數(shù)目在中期分裂相及間期核中均表現(xiàn)出不同的多態(tài)性。德國鏡鯉中期分裂相及間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～2個，含有2個Ag-NORs的頻率最高，分別為80%、56%（見表1，圖1-A）。二倍體泥鰍中期分裂相及間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～2個，含有2個Ag-NORs的頻率最高，分別為72%、60%（見表1，圖1-B）。四倍體泥鰍中期分裂相及間期核中呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為1～4個，中期分裂相中含有3個Ag-NORs的頻率最高，為36%（圖1-C），間期核中含有2個Ag-NORs的頻率最高，為40%（圖1-C，圖1彩版見封三）。

表1 中期分裂相Ag-NORs頻率及間期核中核仁的頻率Table 1 Frequency of Ag-NORs per metaphase and number of nucleolus per interphase nucleu

圖1 德國鏡鯉和不同倍性泥鰍間期核硝酸銀染色Fig.1 Ag-NORs in interphase nuclei from German mirror carp and different ploidy loaches

2.2 Ag-NORs的核型

為了確定攜帶有NOR的染色體在核型中的位置和NORs在染色體上的位置，對德國鏡鯉和不同倍性泥鰍進行銀染核型分析。

2.2.1 德國鏡鯉

2n=100，核型組成為30 m+26 sm+30 st+14 t,NF=156。NOR的染色體在核型中位置和NORs在染色體上的位置是:sm組第8號染色體的短臂末端（見圖2-A,D，圖2彩版見封三）。

2.2.2 二倍體泥鰍

2n=50，核型組成為10 m+4 sm+36 st,NF=64。NOR的染色體在核型中位置和NORs在染色體上的位置是:m組第1號染色體的短臂末端（見圖2-B,E）。

2.2.3 四倍體泥鰍

4n=100，核型組成為20 m+8 sm+72 st,NF=128。NOR的染色體在核型中位置和NORs在染色體上的位置是:m組第1號染色體的短臂末端（見圖2-C,F）。

圖2 德國鏡鯉和不同倍性泥鰍銀染中期分裂相及核型Fig.2 Ag-NORs and Karyotypes in metaphase spreads from German mirror carp and different ploidy loaches

3 討論與結論

3.1 德國鏡鯉與鯉科魚類銀染核型的比較

據(jù)不完全統(tǒng)計，迄今國內已對50余種鯉科魚的Ag-NORs進行分析（見表2），從表2中可以看出，具有4個Ag-NORs的種類占59%；其次是具有2個Ag-NORs占25%；具有6個Ag-NORs占10%；具有8個Ag-NORs占6%。Ag-NORs染色體的類型是:sm占51%；st占25%；t占13%；m占11%。

表2 目前國內已發(fā)表的鯉科魚Ag-NORs資料比較Table 2 The comparison among the currently published Ag-NORs data of Cyprinid fishes in China

續(xù) 表

續(xù) 表

從表2所列舉的銀染資料可以看出，多數(shù)中國鯉科魚類的Ag-NORs數(shù)為4，位于兩對亞中部著絲點染色體的短臂末端，說明中國鯉科魚類具有較特殊的銀染核型。Amwemiya和Gold[29]等通過對50余種北美鯉科魚類研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)都具有一對攜帶NORs的染色體，并指出，具有一對NORs染色體的類型為鯉科魚類的原始類型。Takai和Ojima根據(jù)對日本鯉科魚的分析也認為,具有一對較小的NOR是魚類中較基本和原始的性狀[29]。Glod等根據(jù)“普遍性原則”推測亞端部著絲點染色體短臂上的Ag-NORs為魚類中最原始類型[30]。根據(jù)以上分析,可以認為,中國鯉科魚類的原始NOR特征也應是一對NOR、位于端部著絲粒(st或t)染色體短臂末端。本研究發(fā)現(xiàn)，德國鏡鯉具有2個Ag-NORs,并位于sm染色體上，說明是原始類型。

3.2 德國鏡鯉染色體多倍化

鯉科魚類基本的染色體數(shù)是50或48,這已被大多數(shù)學者所公認。Arai[31]在總結分析了歐亞大陸已作過核型研究的141種鯉科魚類的基礎上，認為2n=50是鯉科魚類最原始的核型，并由2n=50朝幾個方向演化,即:1.通過非整倍性增加或著絲粒斷裂,由2n=50→52；2.通過著絲粒斷裂,由2n=50或48→78；3.通過多倍化增加,由2n=50→100或98；4.通過羅伯遜易位,由2n=50→48,2n=48→44；5.通過缺失而減少,由2n=48→46。在北美鯉科魚類中90%以上的物種染色體數(shù)目2n=50。據(jù)周暾[32]統(tǒng)計和咎瑞光[33]報道，在我國已做過染色體研究的117種鯉科魚類染色體中，2n=50的有49種，占42%，所以眾多學者公認50或48條染色體是鯉科魚類基本的二倍體條數(shù)。這些數(shù)據(jù)說明2n=50的核型是鯉科魚類較原始的核型[23]。近年來,對鯉科魚類染色體研究比較多，從已有的報道中發(fā)現(xiàn),染色體數(shù)2n=100廣泛存在于鯉亞科的鯉屬和鯽屬。本研究德國鏡鯉的染色體數(shù)目為100，是50的2倍，這與已作核型分析的中國鯉魚相同。經銀染分析，最高銀染點數(shù)代表細胞染色體的倍性，四倍體泥鰍具有4個NORs，德國鏡鯉和中國鯉魚均具有2個NORs，分別分布在sm染色體上，與大多數(shù)的中國鯉科魚類NOR表型一致[15]。四倍體泥鰍無論中期分裂相還是間期核最高銀染數(shù)為4個。因此，認為四倍體泥鰍進行加倍后未發(fā)生二倍化或在二倍過程中，而德國鏡鯉與中國鯉魚一樣是多倍化后經歷了二倍化過程演變而來，是二倍化的四倍體。本研究結果可為德國鏡鯉和泥鰍的親緣關系及起源提供細胞遺傳學證據(jù)。

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