董曉巧 杜 權(quán) 俞文華 張祖勇 朱 強(qiáng) 車志豪 陳 鋒 王 昊 陳 軍杭州市第一人民醫(yī)院 杭州 310006

氧化苦參堿是從豆科植物苦參、苦豆子等中分離出來(lái)的生物堿，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，具有抗炎作用[1-3]。但有關(guān)氧化苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子分泌的影響研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察氧化苦參堿對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）分泌的影響，從細(xì)胞水平探討氧化苦參堿的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 BV-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，氧化苦參堿購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，脂多糖購(gòu)于美國(guó)sigma公司，IL-1β、TNF-α 和 IL-6 ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D systems公司。

1.2 分 組 設(shè)對(duì)照組、藥物組、脂多糖組及氧化苦參堿小、中、大劑量組，按 30 min、1 h、3 h 和 6 h 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分設(shè)4個(gè)亞組。對(duì)照組為BV-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，藥物組為BV-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)加氧化苦參堿培養(yǎng)（氧化苦參堿終濃度為20 μg/mL），脂多糖組為BV-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)加脂多糖培養(yǎng)（脂多糖終濃度為1 μg/mL），小、中、大劑量組為 BV-2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)加小、中、大劑量氧化苦參堿培養(yǎng)（氧化苦參堿終濃度為 1、10、20 μg/mL）30 min，再加脂多糖培養(yǎng)（脂多糖終濃度為 1 μg/mL）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種于血清滅活的DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1×105IU/L青霉素，l00 g/L鏈霉素），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。將BV-2細(xì)胞按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積200μL，每組設(shè)定6個(gè)重復(fù)孔，鏡下觀察，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄去孔內(nèi)陳舊培養(yǎng)液，加入無(wú)血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2h使細(xì)胞周期同步化。按分組要求加入相應(yīng)DMEM培養(yǎng)液，依次培養(yǎng)30 min、1 h、3 h 和 6 h。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，吸取各組每孔上清液，以12 000 r/min離心5 min，提取細(xì)胞上清液，于-70℃內(nèi)保存?zhèn)溆?。根?jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β 分泌的影響 在30 min、1 h、3 h和6 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β濃度與藥物組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），脂多糖組IL-1β濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），氧化苦參堿小劑量組白介素-1β濃度與脂多糖組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），氧化苦參堿中劑量組IL-1β濃度顯著低于脂多糖組（P＜0.05），氧化苦參堿大劑量組白介素-1β濃度顯著低于氧化苦參堿中劑量組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌的影響（±s） pg/mL

表1 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌的影響（±s） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與脂多糖組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05

組 別對(duì)照組藥物組脂多糖組小劑量組中劑量組大劑量組n/孔666666 30min 28.0±4.2 26.3±3.9 142.7±6.7*138.3±5.6 98.0±4.9▲70.2±4.0△1 h 29.0±4.9 27.3±5.6 414.3±8.8*407.2±10.3 306.3±8.4▲274.2±7.3△3 h 27.3±4.7 26.0±3.4 508.3±11.5*499.3±8.5 348.2±6.7▲297.2±5.8△6 h 27.1±4.9 26.7±4.4 266.3±9.9*265.0±7.2 205.7±8.2▲176.3±7.3△

2.2 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌的影響 在30 min、1h、3h和6h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α濃度與藥物組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），脂多糖組TNF-α濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），氧化苦參堿小劑量組TNF-α濃度與脂多糖組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），氧化苦參堿中劑量組TNF-α濃度顯著低于脂多糖組（P＜0.05），氧化苦參堿大劑量組TNF-α濃度顯著低于氧化苦參堿中劑量組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤TNF-α分泌的影響（±s） pg/mL

表2 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤TNF-α分泌的影響（±s） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與脂多糖組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05

6 h 244.7±22.4 254.3±21.2 1752.3±110.3*1697.3±117.6 1354.6±122.7▲862.1±95.4△組 別對(duì)照組藥物組脂多糖組小劑量組中劑量組大劑量組n/孔666666 30 min 257.3±22.5 242.3±19.1 1424.0±67.8*1395.7±51.2 981.3±68.5▲665.7±58.6△1 h 260.7±21.8 248.7±24.6 2139.0±89.4*2167.7±68.9 1770.0±99.1▲1113.2±90.7△3 h 250.0±21.8 259.8±19.4 2785.2±151.5*2724.0±129.7 1965.3±136.3▲1482.7±124.5△

2.3 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6分泌的影響 在30 min、1 h、3 h和6 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6濃度與藥物組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），脂多糖組IL-6濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），氧化苦參堿小劑量組IL-6濃度與脂多糖組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），氧化苦參堿中劑量組IL-6濃度顯著低于脂多糖組（P＜0.05），氧化苦參堿大劑量組IL-6濃度顯著低于氧化苦參堿中劑量組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞白介素-6分泌的影響（±s）pg/mL

表3 氧化苦參堿預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞白介素-6分泌的影響（±s）pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與脂多糖組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05

6 h 376.2±70.6 370.6±61.7 4632.2±200.7*4445.5±266.6 2755.5±288.5▲2070.3±182.8△組 別對(duì)照組藥物組脂多糖組小劑量組中劑量組大劑量組n/孔666666 30 min 383.8±52.2 365.5±56.2 2110.5±99.1*2062.2±73.2 1425.7±72.2▲1092.2±83.9△1 h 406.5±50.8 380.5±56.2 6185.5±130.5*6142.2±164.1 4125.5±149.3▲2795.5±134.5△3 h 381.2±50.1 360.5±48.4 7928.8±192.9*7815.7±132.9 5253.8±146.4▲3363.8±168.9△

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)和損害的雙重作用，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞一方面通過(guò)吞噬清除病原體和細(xì)胞碎片保護(hù)神經(jīng)元，另一方面通過(guò)分泌一系列炎性因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)[4-6]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷起到一定的保護(hù)作用。

氧化苦參堿是從豆科植物苦參、苦豆子等中分離出來(lái)的生物堿，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，其化學(xué)分子式是C15H24N20，為白色針形棱柱形晶體或白色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭、味苦，具有抗肝炎病毒、抗心律失常、抗癲癇，抗肝、腎和心臟纖維化、抗腫瘤等作用[7-12]。氧化苦參堿具有重要的抗炎作用，可作用于非特異性的炎癥反應(yīng)，它的抗炎作用無(wú)需依賴垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)；氧化苦參堿具有雙向調(diào)節(jié)的抗炎作用，低濃度時(shí)可刺激淋巴細(xì)胞增生，高濃度時(shí)則抑制淋巴細(xì)胞增生[13]。

氧化苦參堿也具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗炎作用，可降低腦組織核因子-κB水平，抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，從而減少局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積[14]；可通過(guò)抑制12/15-脂氧合酶介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路從而保護(hù)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能[15]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可通過(guò)抑制Toll樣受體4/核因子-κB信號(hào)途徑，減少膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α和IL-6釋放，從而減少腦外傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]。本研究觀察氧化苦參堿對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α和IL-6分泌的影響，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿劑量依賴性地降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度。研究結(jié)果顯示，氧化苦參堿對(duì)脂多糖所致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化具有顯著的抑制作用，推測(cè)抗炎作用可能是氧化苦參堿神經(jīng)保護(hù)的重要機(jī)制。

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