傅海慶，周 陽(yáng)，傅華英

(1．福建農(nóng)林大學(xué) 金山學(xué)院，福建 福州 350002;2．福建農(nóng)林大學(xué) 作物學(xué)院，福建 福州 350002)

桑黃(Phellinus igniarius)是一種珍貴的藥用真菌，也是目前國(guó)際公認(rèn)的抗腫瘤效果最好的藥用真菌之一［1－3］。它含有多糖、黃酮、麥角甾醇、香豆素、多肽等多種藥理成分，其中的多糖具有提高免疫力、抗癌、抗腫瘤、抗肝纖維化、抗菌、抗誘變、降低血糖等多方面功能［4－13］。因此，桑黃已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外保健品行業(yè)與醫(yī)藥制劑研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一，市場(chǎng)前景非常廣闊［14－15］。但是，我國(guó)桑黃野生資源匱乏，采用固料栽培的方法不僅產(chǎn)量低，而且生長(zhǎng)期很長(zhǎng)，這些嚴(yán)重制約了桑黃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。所以對(duì)于桑黃菌液體發(fā)酵的研究，使其獲得大量的菌絲體具有十分重要的意義。本文探討了桑黃菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基配方優(yōu)化篩選，為進(jìn)一步研究桑黃液體發(fā)酵工藝提供有益試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 桑黃菌種由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏管理中心提供，編號(hào)為ph．I0001。

1．1．2 原料 黃豆、土豆、玉米粉，均從普通市場(chǎng)購(gòu)得。

1．1．3 主要試劑 酵母提取粉、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、葡萄糖、瓊脂為生化試劑，維生素B1為醫(yī)藥品，其它試劑均為分析純。

1．1．4 供試培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA);搖瓶液體種子培養(yǎng)基配方(g/L):玉米粉40、黃豆粉 20、KH2PO44、MgSO42、VB10．1、pH 自然。

1．1．5 主要儀器設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器、LP1002B電子天平、凈化工作臺(tái)、可調(diào)速旋轉(zhuǎn)式搖床、生物顯微鏡、DHG－9240A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。

1．2 方法

1．2．1 菌種培養(yǎng) (1)菌種的固體斜面培養(yǎng):將桑黃菌種接種在固體斜面馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面為止，冷藏備用。

(2)搖瓶液體種子培養(yǎng)液培養(yǎng):在250 mL三角瓶中裝量100 mL培養(yǎng)液，一級(jí)種子接入約1．5 cm2的斜面菌種2塊，二級(jí)發(fā)酵是按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量接入種子培養(yǎng)液，在28℃溫度下以轉(zhuǎn)速135 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)5 d而得。

1．2．2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)方法 (1)液體發(fā)酵碳源的試驗(yàn)。碳源試驗(yàn)中選擇了葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉等5種常見(jiàn)的原料作為碳源，分別替換液體種子培養(yǎng)基中的玉米粉，并按20 g/L加入量組成新配方進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，研究不同碳源對(duì)桑黃菌絲體生長(zhǎng)的影響，從而可篩選出適合桑黃菌生長(zhǎng)的最佳碳源。并進(jìn)一步針對(duì)最佳碳源，選取其加入濃度分別為5，10，15，20，30，40 g/L組成配方進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)5 d后分別測(cè)定所獲桑黃菌絲體的干質(zhì)量，篩選出最適濃度。

(2)液體發(fā)酵氮源的試驗(yàn)。氮源試驗(yàn)選擇了硫酸銨、酵母提取粉、蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉等5種常見(jiàn)的原料作為氮源，分別替換液體種子培養(yǎng)基中的黃豆粉，并按20 g/L加入量組成新配方進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，研究不同氮源對(duì)桑黃菌絲體生長(zhǎng)的影響，從而可篩選出適合桑黃菌生長(zhǎng)的最佳氮源。并進(jìn)一步針對(duì)最佳氮源，選取其加入濃度分別為5，10，15，20，30，40 g/L組成配方進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)5 d后分別測(cè)定所獲桑黃菌絲體干質(zhì)量，篩選出最適濃度。

(3)液體發(fā)酵無(wú)機(jī)鹽的試驗(yàn)。藥用菌的生長(zhǎng)發(fā)育還需要適量的礦物質(zhì)元素，這些礦物質(zhì)元素參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成、酶的組成、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓等。本試驗(yàn)選擇了5種不同無(wú)機(jī)鹽，即NaCl、CaCl2、KCl、Na2CO3、Ca(NO3)2，分別按2．0 g/L添加到搖瓶液體種子培養(yǎng)基中形成不同的配方進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，考察不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)桑黃菌絲體生長(zhǎng)的影響。并進(jìn)一步針對(duì)最佳無(wú)機(jī)鹽，選取其加入濃度分別為1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5 g/L組成配方進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)5 d后分別測(cè)定所獲桑黃菌絲體干質(zhì)量，篩選出最適濃度。1．2．3 多因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取玉米粉作為碳源、黃豆粉作為氮源、氯化鉀作為無(wú)機(jī)鹽作三因素三水平的L9(34)正交試驗(yàn)，以分別添加KH2PO44．0 g/L、MgSO42．0 g/L、VB10．1 g/L為固定因子。共9個(gè)組合，以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，以確定各因素對(duì)桑黃菌絲體干質(zhì)量的影響，優(yōu)化篩選桑黃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的較優(yōu)配方。

1．2．4 菌絲干質(zhì)量的測(cè)定方法 用20目的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩過(guò)濾菌絲，并用清水洗滌2～3次，放于60℃恒溫干燥箱中烘干，稱量其干質(zhì)量，計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2．1．1 不同碳源種類及濃度對(duì)桑黃菌絲產(chǎn)量的影響 經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得各碳源對(duì)應(yīng)的菌絲產(chǎn)量如圖1所示，可以看出不同的碳源種類獲得的菌絲產(chǎn)量是不同的，以玉米粉為碳源時(shí)獲得的菌絲產(chǎn)量最高，桑黃菌絲體干質(zhì)量為 0．78 g/100 mL，因此確定它為最佳碳源。

進(jìn)一步以玉米粉做梯度試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加玉米粉質(zhì)量濃度為5～30 g/L時(shí)，菌絲體干質(zhì)量呈上升趨勢(shì);當(dāng)添加質(zhì)量濃度大于30 g/L時(shí)，菌絲體干質(zhì)量開(kāi)始下降;故添加質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)其菌絲體產(chǎn)量最大，為0．67 g/100 mL。因此，確定玉米粉的最佳添加量為30 g/L。

2．1．2 不同氮源種類及濃度對(duì)桑黃菌絲產(chǎn)量的影響 經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得各氮源對(duì)應(yīng)的菌絲產(chǎn)量如圖3所示。可以看出不同的氮源得到的菌絲體產(chǎn)量也不同，使用酵母提取粉和黃豆粉所獲得的菌絲體產(chǎn)量較大，兩者并無(wú)顯著差異，若是大批量生產(chǎn)，可考慮使用黃豆粉更經(jīng)濟(jì)。因此，可選擇黃豆粉為最佳氮源。

進(jìn)一步以黃豆粉做梯度試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。當(dāng)培養(yǎng)基中黃豆粉添加量為5～15 g/L時(shí)，桑黃菌絲體干質(zhì)量呈上升趨勢(shì);當(dāng)添加量大于15 g/L時(shí)，其干質(zhì)量開(kāi)始下降;故添加量為15 g/L時(shí)，獲得菌絲體干質(zhì)量最大，為 0．34 g/L。因此，確定黃豆粉的添加量應(yīng)為15 g/L。

2．1．3 不同無(wú)機(jī)鹽種類及濃度對(duì)桑黃菌絲產(chǎn)量的影響 經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得各無(wú)機(jī)鹽對(duì)應(yīng)的菌絲產(chǎn)量如圖5所示。添加不同的無(wú)機(jī)鹽所得到的菌絲干質(zhì)量是不同的，其中以添加氯化鉀所得到的干菌絲產(chǎn)量最高。

圖1 不同碳源對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響Fig．1 Effect of carbon source on the mycelium dry weight

圖2 玉米粉對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響Fig．2 Effect of corn flour on the mycelium dry weight

圖3 不同氮源對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響Fig．3 Effect of nitrogen source on the mycelium dry weight

圖4 黃豆粉對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響Fig．4 Effect of soybean powder on the mycelium dry weight

進(jìn)一步以氯化鉀作濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)基中氯化鉀添加量為1～2 g/L時(shí)，桑黃菌絲體干質(zhì)量呈上升趨勢(shì);當(dāng)添加量大于2 g/L時(shí)，其干質(zhì)量開(kāi)始下降;故添加量為2 g/L時(shí)，獲得菌絲體干質(zhì)量最大，為0．29 g/L。因此，確定氯化鉀的添加量應(yīng)為2 g/L。

2．2 多因素的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

多因素的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析表明:試驗(yàn)與理論較優(yōu)組合均為A2B1C2即玉米粉30 g/L，黃豆粉 10 g/L，氯化鉀 2 g/L，KH2PO44 g/L、MgSO42 g/L、VB10．1 g/L，該組合恰好為第4試驗(yàn)號(hào)的組合，使桑黃菌在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下其菌絲體干質(zhì)量可達(dá)2．23 g/100mL。

圖5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響Fig．5 Effect of inorganic salt on the mycelium dry weight

3 討論

本試驗(yàn)僅對(duì)桑黃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方中碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽種類及濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選，初步獲得了較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)配方，即玉米粉30 g/L，黃豆粉10 g/L，氯化鉀2 g/L，KH2PO44 g/L、MgSO42 g/L、VB10．1 g/L，使桑黃菌在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下其菌絲體干質(zhì)量可達(dá)2．23 g/100 mL。為進(jìn)一步探索桑黃的搖瓶發(fā)酵工藝條件提供了較有價(jià)值的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用篩選到較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方，分別進(jìn)行不同起始pH值、不同搖瓶裝量、不同接種量、不同溫度、不同搖瓶轉(zhuǎn)速和不同發(fā)酵周期等發(fā)酵條件的憂化篩選有待進(jìn)一步深入研究。

圖6 不同KCl質(zhì)量濃度對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響Fig．6 Effect of KCl on the mycelium dry weight

表1 多因素的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．1 The results of multi factor L9(34)orthogonal test

［1］郭忠軍．桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)液初步研究［J］．黑龍江醫(yī)藥，2005，18(3):198－199．

［2］劉正南，鄭淑芬．中國(guó)藥用真菌的現(xiàn)狀和種植資源［J］．中國(guó)食用菌，1996，17(6):22－24．

［3］傅海慶，陳紹軍，陳漢清，等．桑黃口服液對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，35(5):538－541．

［4］宋力，孔培龍，郭彬彬，等．桑黃的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)食用菌，2005(3):24．

［5］李翠翠，尉玉曉，郭立忠．桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的初步研究［J］．中國(guó)食用菌，2009，28(2):46－48．

［6］傅海慶．桑黃多糖的研究進(jìn)展［J］．包裝與食品機(jī)械，2008，26(5):32 －36．

［7］秦俊哲，姚艷芳．桑黃菌絲的最適培養(yǎng)條件研究［J］．食用菌，2007，29(1):6－9．

［8］胡文彬，馬海樂(lè)，周存山．桑黃菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件研究［J］．中國(guó)食用菌，2006(3):49－51．

［9］李朔，丁一新，徐霽．桑黃胞內(nèi)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］．食品科學(xué)，2006(11):236－240．

［10］戴玉成．藥用擔(dān)子菌:鮑氏層孔菌(桑黃)的新認(rèn)識(shí)［J］．中草藥，2003，34(1):94－95．

［11］劉春輝，陳體強(qiáng)，林躍鑫．藥用真菌桑黃的研究進(jìn)展［J］．菌物研究，2004，2(2):53－59．

［12］莫順燕，楊永春，石建功．桑黃化學(xué)成分研究［J］．中草藥，2004，35(10):1095 －1097．

［13］莫順燕，楊永春，石建功．桑黃化學(xué)成分研究［J］．中草藥，2003，28(4):339 －341．

［14］呂英華，王建芳，李玉平，等．藥用真菌桑黃的研究進(jìn)展［J］．蠶業(yè)科學(xué)，2009，35(1):204 －210．

［15］齊欣，張峻，陳穎．珍稀真菌桑黃的研究進(jìn)展［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(5):172－174．