杜金梁，賈 睿，曹麗萍，殷國俊

(中國水產(chǎn)科學研究院 淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081)

肝損傷是多因素參與的復雜過程，自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在肝損傷及肝疾病中起著十分重要的作用[1]。有研究表明，虎杖對過氧化脂質(zhì)具有清除作用，對肝細胞有保護作用?；⒄燃鍎┚哂懈纳茡p傷肝組織的微循環(huán)，抑制白細胞、血小板與肝臟內(nèi)皮細胞的粘附，達到促進肝細胞再生、修復損傷的能力[2－3]?；⒄葹檗た浦参锘⒄鹊母o，含有多種藥理活性成分，其主要有效成分為黎蘆醇苷，具有擴血管、抗血輇、抗休克、降血脂及抗氧化等作用;另外，虎杖還具有抗菌、抗病毒及保肝等作用[4－6]。目前關(guān)于虎杖的研究在水產(chǎn)上未見有相關(guān)報道，本實驗研究了不同劑量的虎杖提取物對CCl4致建鯉急性肝損傷的影響，以期為篩選魚類保肝藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 試驗用建鯉取自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質(zhì)健康、無傷，體質(zhì)量為30 g左右。將建鯉飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，培養(yǎng)水溫為25℃，每天投喂2次飼料。

1.1.2 試劑和儀器 虎杖提取物，購自南通四海植物精華有限公司;LDH、GPT、GOT、TP、ALB，SOD、GSH-Px、MDA、CAT、T-AOC均購自南京建成生物工程有限公司;723型分光光度計，購自上海欣茂儀器有限公司。

1.1.3 飼料配制 試驗日糧為基礎(chǔ)日糧，魚粉8%、豆餅20%、棉籽餅20%、米糠20%、麩皮21%、土面3.5%、槐葉粉6%、骨粉1%、食鹽0.5%。粗蛋白為30.3%，粗脂肪為6.4%，粗灰分7.1%。各種原料分別粉碎過60目篩，先把魚粉、土面、食鹽等混勻，再加大料逐級充分混勻，后加適量水，用小型絞肉機制成粒徑2.0 mm的濕顆粒飼料，晾干備用。在基礎(chǔ)日糧中分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.5%和1%的虎杖提取物。

1.2 方法

1.2.1 試驗組別劃分及處理 選取體質(zhì)健康、無傷，體質(zhì)量為30 g左右的建鯉120條，隨機將建鯉設(shè)5個處理組，1個對照組，每組20條。每日飼喂2次，按體質(zhì)量的2%來確定飼喂量，連續(xù)飼喂8周。I(CCl4)組:只飼喂基礎(chǔ)飼，連續(xù)飼喂8周后，按建鯉體質(zhì)量每10 g注射0.05 mL標準體內(nèi)注射30%CCl4(溶于植物油中);II、III(0.5%虎杖提取物、1%虎杖提取物)組:分別在基礎(chǔ)日糧添加0.5%、1%虎杖提取物，連續(xù)飼喂8周后，按建鯉體質(zhì)量每10 g注射0.05 mL標準體內(nèi)注射CCl4;IV、V(0.5%虎杖提取物、1%虎杖提取物)對照組:分別在基礎(chǔ)日糧添加0.5%、1%虎杖提取物，連續(xù)飼喂8周后，不進行體內(nèi)CCl4注射，按體質(zhì)量每10 g注射0.05 mL標準進行植物油注射;VI(空白對照)組，只飼喂基礎(chǔ)日糧，連續(xù)飼喂8周后，按體質(zhì)量每10 g注射0.05 mL標準進行植物油注射。

1.2.2 CCl4誘導肝損傷模型的建立 連續(xù)飼喂8周，停止飼喂，然后進行造模實驗。實驗分為空白對照組(control)和CCl4組，CCl4設(shè)4個濃度梯度(12.5%、25%、30%和50%的CCl4-植物油混合溶液)，每條魚以5 mL/kg的劑量腹腔注射CCl4和植物油，在注射后24、48、72、96、120和144 h分別采血和肝臟組織，測定血清中GOT、GPT、LDH，每組10條魚。由于50%的CCl4會造成魚致死，因此不進行結(jié)果分析。

1.2.3 樣品采集及制備 分別于建鯉尾靜脈采集血液2 mL，3 000 r/min離心15 min來分離血清，于－20℃條件下保存?zhèn)溆?。采集建鯉肝臟，將肝臟用生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，稱取0.1 g加9倍生理鹽水，剪碎后置玻璃勻漿機中研成10%的組織勻漿，2 000 r/min離心10 min，取上清液于－20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、CAT、T-AOC的測定 取勻漿后上清液按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作方法進行各項指標測定。

1.2.5 血清中LDH、GPT、GOT、TP、ALB的測定 取建鯉血清，按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作方法進行各項指標測定。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件包進行處理。采用One-Way ANOVA檢驗法進行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標準誤表示，對樣本間進行t檢驗，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

圖1 CCl4對鯉魚血清中GPT、GOT和LDH的影響Fig.1 Effects of CCl4on activity of GPT，GOT and LDH in seurum of carps

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的CCl4對鯉魚血清中GPT、GOT和LDH活性的影響

由圖1可知，血清中GPT、GOT和LDH含量隨著CCl4濃度的增大而升高。與空白對照(control)組相比，12.5%的CCl4對3種酶活性影響差異不顯著(P＞0.05);25%的CCl4在24、48和72 h極顯著提高了GPT和GOT的溢出量(P＜0.01);30%的CCl4在24、48和72 h顯著的提高了GPT、GOT和LDH在血清中的含量(P＜0.05或P＜0.01)。在96、120和144 h采集的血清中這3種酶活性其含量也有所升高，但與對照組相比沒有顯著性差異。

2.2 建鯉血清中LDH、GPT、GOT活性的測定結(jié)果

由表1可知，CCI4造模組GPT、GOT、LDH活性顯著升高，GOT、LDH活性與對照相比，差異極顯著(P＜0.01);GPT活性與空白對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。不同濃度的虎杖提取物均可以降低血清中GPT、GOT、LDH的活性，與CCI4組相比，0.5%的虎杖提取物保肝效果最明顯;與空白對照組相比，0.5%的虎杖提取物差異不顯著(P＞0.05)。而0.5%和1%虎杖提取物對照組則無明顯變化。

表1 不同濃度虎杖提取物對建鯉血清中LDH、GPT、GOT活性的影響(n=10)Tab.1 Effects of different concentrations of polygonum cuspidatum extract on the content of serum LDH、GPT、GOT in Jian Carp(n=10)

2.3 建鯉血清中TP、ALB活性和肝組織中抗氧化酶指標T-AOC、CAT的測定結(jié)果

由表2可知，CCl4造模組TP、ALB活性顯著下降，與空白對照組相比，差異顯著 (P＜0.05)。不同濃度的虎杖提取物對于抗CCl4誘導的肝損傷有顯著效果，能顯著增加TP、ALB活性。與CCl4組相比，0.5%和1%虎杖提取物組差異顯著，以1%的虎杖提取物組效果最佳。與空白對照組相比，1%的虎杖提取物差異不顯著(P＞0.05)。而0.5%和1%虎杖提取物對照組則無明顯變化。

表2 不同濃度虎杖提取物對建鯉血清中TP、ALB活性和肝組織中T-AOC、CAT的影響(n=10)Tab.2 Effects of different concentrations of polygonum cuspidatum extract on the content of serum TP、ALB and on the antioxidant indexes of liver tissue T-AOC、CAT in Jian Carp(n=10)

由表2還可知，CCl4造模組T-AOC和CAT含量均顯著下降，與空白對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。當不同濃度虎杖提取物作用于肝組織時，1%的虎杖提取物能顯著提高CAT含量，與CCl4造模組相比，差異極顯著(P＜0.01);與空白對照組相比，差異不顯著(P＞0.05);而0.5%和1%虎杖提取物對照組則無明顯變化。

2.4 肝組織中抗氧化酶指標SOD、GSH-Px、MDA的測定結(jié)果

由表3可知，CCl4造模組SOD、GSH-Px顯著下降，MDA活性顯著增加，與Control組相比，差異顯著(P＜0.05)。當不同濃度虎杖提取物作用于肝組織時，1%的虎杖提取物能顯著提高SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，與空白對照組相比，差異不顯著(P＞0.05);與CCI4組相比，差異顯著 (P＜0.05);而0.5%和1%虎杖提取物對照組則無明顯變化。

3 結(jié)論與討論

CCl4所造成的肝損傷模型是比較經(jīng)典的化學性肝損傷動物模型，被廣泛應(yīng)用到哺乳動物上面[7－8]，但是關(guān)于水產(chǎn)上面CCl4所造成的肝損傷研究卻不多見，本實驗室利用CCl4已成功制備了建鯉肝損傷模型，為水產(chǎn)上面研究肝損傷奠定了基礎(chǔ)。在本實驗中通過將不同濃度CCl4作用肝組織不同的時間段，建鯉血清中GPT、GOT和LDH的含量有不同程度的升高。當CCl4濃度達到25%和30%時，隨著時間的延長，3種酶的溢出量極顯著的上升，與空白對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，當作用時間超過72 h時，CCl4的損害程度有變?nèi)踮厔荩?種酶在血清中的看量漸漸恢復正常。因此急性肝損傷模型的時間選擇在72 h之內(nèi)。

表3 不同濃度虎杖提取物對建立建鯉肝組織中抗氧化酶指標SOD、GSH-Px、MDA的影響(n=10)Tab.3 Effects of different concentrations of polygonum cuspidatum extract on the antioxidant indexes of liver tissue SOD，GSH-Px，MDA in Jian carp(n=10)

有資料表明CCl4所致肝損傷是典型的脂質(zhì)過氧化損傷，可引起脂質(zhì)過氧化，使肝細胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶從受損的肝細胞內(nèi)溢出，使血清中轉(zhuǎn)氨酶升高[9－10]。在生理情況下，生物體內(nèi)氧自由基雖然不斷地產(chǎn)生，但也不斷地被清除。但是在某些病理情況下，由于機體清除氧自由基產(chǎn)生過多，引起氧自由基含量升高，導致組織損傷而發(fā)生疾病。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物，其含量的大小可以間接反映自由基對組織的破壞程度。MDA通常和SOD或者GSH-Px聯(lián)合使用，一起反映氧自由基對細胞的損傷程度。在本實驗中，CCl4造模組SOD、GSH-Px顯著下降，MDA活性顯著增加，與空白對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。當不同濃度虎杖提取物作用于肝組織時，1%的虎杖提取物能顯著提高SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，說明1%的虎杖提取物對于清除氧自由基方面作用顯著，對于防治肝損傷有很好的效果。

GOT與GPT是反映肝病變情況最敏感的指標，當機體組織受到損傷時，血清中轉(zhuǎn)氨酶含量會升高，而血清轉(zhuǎn)氨酶的升高反映了肝細胞受到損傷，其高低大小同時也反映了損傷程度。乳酸脫氫酶(LDH)在體內(nèi)廣泛分布但缺乏特異性，當發(fā)生肝病時其同工酶LDH5增高顯著。本試驗中由CCl4誘導的肝組織損傷GOT、GPT與LDH含量顯著升高，尤其是GPT含量差異極顯著(P＜0.01)。將0.5%和1%的虎杖提取物添加到飼料當中發(fā)現(xiàn)，0.5%的虎杖提取物對于防治肝損傷有很好效果，可以顯著降低GOT、GPT、LDH 含量。

血清總蛋白及白蛋白是反映肝功能正常與否的兩個重要指標[11－13]，當肝臟損害達到一定程度時，兩個指標在血清中的含量便會發(fā)生變化，本試驗中，在CCl4所造成的肝損傷中，TP與ALB的代謝發(fā)生了異常變化，含量均顯著降低，而在保肝藥物虎杖提取物組，0.5%和1%的虎杖提取物對于抗CCl4損傷有很好的效果，與CCl4組相比，差異顯著(P＜0.05);與空白對照組相比，差異不顯著(P＞0.05)，以0.5%的虎杖提取物保肝效果最好。

過氧化氫酶(CAT)廣泛存在于動物的各個組織中，以肝臟中濃度居高，在調(diào)節(jié)細胞免于活性氧的氧化損傷過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。CAT在一定條件下可清除機體產(chǎn)生的自由基，使其濃度逐漸降低，保護機體免受損害。而T-AOC是用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，反映了由谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等酶促系統(tǒng)和由維生素E、谷胱甘肽、維生素C等組成的非酶促系統(tǒng)的總的抗氧化能力，T-AOC的大小可從總體上反映機體防御系統(tǒng)抗氧化能力的高低[15－16]。本試驗中當CCl4造成肝損傷時，T-AOC和CAT含量均顯著下降，與空白對照組相比，差異顯著 (P＜0.05)。1%虎杖提取物保肝組效果明顯，能顯著提高T-AOC和CAT含量，與空白對照組相比，差異不顯著(P＞0.05)，對于治療肝損傷有很好的療效。

綜上所述，基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度的虎杖提取物可以在一定程度上提高建鯉機體的抗氧化功能，降低氧自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，保護細胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整，緩解CCl4對建鯉肝組織損害。尤其是1%的虎杖提取物效果最明顯，為以后魚類肝膽綜合癥治療的藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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