高志云 藍(lán)佳明 金玉懷 李 劍 劉貴霞 羨 仙 張永紅 王永祥

(河北醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，石家莊050017)

柯薩奇病毒 B組 3型(Coxsackievirus B3，CVB3)感染所致的病毒性心肌炎嚴(yán)重危害人類健康。自病原體確立以來(lái)，已開(kāi)展大量疫苗研發(fā)工作，但并沒(méi)有獲得滿意的進(jìn)展。研究顯示，CVB3衣殼蛋白1(Capsid protein1，VP1)是其主要的中和抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。

本室前期構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-his/VP1，證實(shí)表達(dá)VP1蛋白，并且將分泌型CVB3 VP1的基因和三拷貝C3d分子的基因拼接，構(gòu)建成靶向B細(xì)胞的融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1和rAd/C3d3-sVP1［1，2］。為篩選較好的候選疫苗，本研究將VP1蛋白、pcDNA3/C3d3-sVP1和 rAd/C3d3-sVP1分別免疫小鼠，通過(guò)觀察不同疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平，以及病毒攻擊后的免疫保護(hù)作用來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株和病毒株 人宮頸癌細(xì)胞系(He-La)細(xì)胞，本室保存;人胚腎293(HEK293)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心;大腸桿菌E.coli DH5α 和 BL21(DE3)pLysS，CVB3 Nancy株，本室保存。

1.2 質(zhì)粒、重組腺病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-his/VP1、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/C3d3-sVP1和重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1，本室前期構(gòu)建。6～8周齡雄性純系BALB/c小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試劑 各種工具酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司;腺病毒沉淀法純化試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所?？笻is單克隆抗體(mAb)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉公司。其他試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)外生物公司。

1.4 質(zhì)粒的大量提取與純化 將pcDNA3/C3d3-sVP1轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，然后接種至2YT液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)，于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體，按堿裂解法大量制備質(zhì)粒，并用PEG法對(duì)之進(jìn)行純化，定量后保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組腺病毒的大量擴(kuò)增與純化 大量培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，將第三代重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1分別感染293細(xì)胞。當(dāng)大部分細(xì)胞(約80%)出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，收集細(xì)胞，用腺病毒純化試劑盒純化。用GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 VP1蛋白的表達(dá)和純化 按參考文獻(xiàn)［3］方法，將表達(dá)CVB3VP1蛋白的重組質(zhì)粒pET-his/VP1轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌E.coli BL21(DE3)pLysS中，然后轉(zhuǎn)種于 LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時(shí)，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，于30℃誘導(dǎo)5小時(shí)。用超聲波裂解細(xì)菌，離心后收集包涵體沉淀，用Western blot鑒定蛋白。其余沉淀用尿素溶解，用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，透析后濃縮定量保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 免疫接種 6～8周齡雄性純系BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組18只，分別于股四頭肌注射PBS、pcDNA3/C3d3-sVP1、rAd/C3d3-sVP1 與 VP1蛋白。PBS組、pcDNA3/C3d3-sVP1質(zhì)粒組與VP1蛋白組免疫3次，間隔3周;rAd/C3d3-sVP1腺病毒組免疫2次，間隔2周。質(zhì)粒接種前注射25%高滲蔗糖溶液100μl，20分鐘后原位注射質(zhì)粒100μg/100μl;重組腺病毒每次每只1.2×107pfu/100μl;PBS組每次每只注射100μl;VP1蛋白初次免疫加完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑，每次每只接種50μg。

1.8 血清特異性IgG檢測(cè) 采用ELISA方法。每次接種后第14天內(nèi)眥靜脈取血，分離血清。用純化的VP1蛋白包被96孔酶標(biāo)板，洗滌后加入2倍系列稀釋的上述小鼠血清，每個(gè)稀釋度4復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性和空白對(duì)照孔，37℃孵育2小時(shí)，洗滌后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG，再次洗滌后加TMB顯色。用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm吸光度(A)值。(試驗(yàn)孔A450-空白對(duì)照孔A450)/(陰性對(duì)照孔A450-空白對(duì)照孔A450)≥2.1時(shí)判為陽(yáng)性。以陽(yáng)性孔最高血清稀釋度的倒數(shù)作為該血清IgG抗體滴度。

1.9 中和抗體檢測(cè) 采用微量中和試驗(yàn)方法。取上述小鼠血清置56℃水浴30分鐘滅活，用 RPMI1640維持液(含青、鏈霉素各100 U/ml)稀釋成1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，共 7 個(gè)稀釋度。將各稀釋度血清加入96孔板中，每個(gè)稀釋度4個(gè)復(fù)孔，每孔50μl。每孔加入100TCID50CVB3 50 μl，于37℃ 5%CO2孵育60分鐘。HeLa單層細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)濃度為5×108ml-1，每孔加入50μl。另設(shè)病毒對(duì)照孔、血清對(duì)照孔和細(xì)胞對(duì)照孔，于37℃ 5%CO2孵育，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。以能保護(hù)細(xì)胞不出現(xiàn)細(xì)胞病變的最高血清稀釋度的倒數(shù)作為該血清標(biāo)本的中和抗體滴度。

1.10 特異性CTL檢測(cè) 末次免疫后3周，每組取3只小鼠處死，無(wú)菌取脾。將脾淋巴細(xì)胞用IL-2、ConA和滅活的CVB3體外刺激3天，作為效應(yīng)細(xì)胞。用滅活的CVB3體外刺激1天的SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞。以效靶比為40∶1進(jìn)行試驗(yàn)，靶細(xì)胞以含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋至1×105ml-1，加入96孔板中，每孔100μl，每孔加入效應(yīng)細(xì)胞100μl，同時(shí)加入IL-2、ConA和滅活的CVB3刺激，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，采用CCK-8法檢測(cè)脾細(xì)胞殺傷活性，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞孔和靶細(xì)胞孔各3復(fù)孔。殺傷率(%)=［1-(效靶A值-效應(yīng)細(xì)胞A值)/靶細(xì)胞A值］×100%。

1.11 血中病毒滴度測(cè)定 末次免疫后3周，每組取3只小鼠，腹腔注射3LD50的CVB3。第7天取血后分離血清，用RPMI1640細(xì)胞維持液10倍系列稀釋，接種HeLa單層細(xì)胞，于37℃ 5%CO2條件下孵育并逐日觀察CPE，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的滴度。

1.12 攻毒試驗(yàn) 末次免疫后3周，小鼠腹腔注射含4LD50的 CVB3的病毒液0.2 ml/只，觀察各組小鼠的存活情況至感染后第21天。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠中和抗體、血清特異性IgG抗體水平、CTL的殺傷率和病毒滴度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用SNK檢驗(yàn);生存率和生存時(shí)間的比較分別采用卡方檢驗(yàn)。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3/C3d3-sVP1的酶切電泳結(jié)果Fig.1 Digestion results of pcDNA3/C3d3-sVP1

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pcDNA3/C3d3-sVP1的鑒定 大量制備的質(zhì)粒經(jīng)提純后酶切鑒定，除可見(jiàn)預(yù)期的特異性條帶外，未見(jiàn)其他非特異性條帶(圖1)。

2.2 重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1的培養(yǎng) 重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1感染293細(xì)胞后，用熒光顯微鏡可觀察到腺病毒增殖情況(圖2)。

2.3 VP1蛋白的鑒定 將純化后蛋白進(jìn)行SDSPAGE，用His單抗作Western blot檢測(cè)顯示，相對(duì)分子質(zhì)量在33 000左右有一條清晰的目的條帶(圖3)。

2.4 血清特異性IgG水平 結(jié)果顯示，除PBS組未檢測(cè)到VP1特異性IgG抗體外，其余各組IgG抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而提高(P＜0.05);末次免疫后各組比較，VP1蛋白組抗體滴度顯著高于pcDNA3/C3d3-sVP1和 rAd/C3d3-sVP1組(P ＜0.05)，提示3種疫苗均能誘導(dǎo)出較強(qiáng)的特異性抗體，但以VP1蛋白疫苗最為顯著(見(jiàn)表1)。

2.5 血清中和抗體水平 PBS組各次平均效價(jià)均低于1∶5，其余3組中和抗體滴度逐次增加(P＜0.05)。各組各次免疫后血清中和抗體平均滴度見(jiàn)表2。從表中可以看出，末次免疫后，VP1蛋白組的中和抗體滴度明顯高于pcDNA3/C3d3-sVP1組和rAd/C3d3-sVP1 組(P ＜0.05)。

圖2 熒光顯微鏡觀察重組腺病毒r Ad/C3d3-sVP1感染的HEK293細(xì)胞(×200)Fig.2 Fluorescence microscopy analysis of recombinant adenovirus r Ad/C3d3-sVP1 production(×200)

圖3 重組蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western blot analysis of the purposing protein by His antiboby

表1 血清特異性VP1 IgG滴度(±s)Tab.1 Mean sera specific VP1 IgG titers±s)

表1 血清特異性VP1 IgG滴度(±s)Tab.1 Mean sera specific VP1 IgG titers±s)

Note:After the last immunization:compared with pcDNA3/C3d3-sVP1，1)P ＜0.05;compared with rAd/C3d3-sVP1，2)P ＜0.05.

Groups After first immunization After second immunization After third immunization pcDNA3/C3d3-sVP1 66.07 ±1.78 199.99 ±2.24 459.41 ±2.64 rAd/C3d3-sVP1 62.95 ±1.35 799.83 ±1.291)VP1 protein 398.84 ±1.32 20 995.62 ±1.681)2) 36 300.11 ±1.821)2)

表2 平均的中和抗體滴度±s)Tab.2 Mean neutralizing antibody titers(±s)

表2 平均的中和抗體滴度±s)Tab.2 Mean neutralizing antibody titers(±s)

Note:After the last immunization:compared with pcDNA3/C3d3-sVP1，1)P ＜0.05;compared with rAd/C3d3-sVP1，2)P ＜0.05.

Groups After first immunization After second immunization After third immunization pcDNA3/C3d3-sVP1 8.41 ±1.81 25.19 ±1.86 33.65 ±1.70 rAd/C3d3-sVP1 8.91 ±1.32 56.63 ±1.321)VP1 protein 8.91 ±1.31 47.86 ±1.37 70.79 ±1.311)2)

圖4 4LD50攻擊后小鼠生存曲線Fig.4 Survival curve of BALB/c mice challenged with 4LD50 CVB3

2.6 特異性CTL殺傷活性 當(dāng)效靶比為40∶1時(shí)，小鼠脾臟特異性殺傷活性分別為:PBS組(24.53±4.65)%、pcDNA3/C3d3-sVP1 組(36.33 ±2.52)%、rAd/C3d3-sVP1組(67.31 ±2.54)% 和 VP1 組(47.39±4.01)%。結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞CTL殺傷活性均高于PBS組(P＜0.05);rAd/C3d3-sVP1組高于pcDNA3/C3d3-sVP1組和VP1蛋白組(P ＜0.05)。

2.7 血中病毒滴度 與PBS對(duì)照組(5.67±0.15)相比，其余各組小鼠血中病毒滴度顯著降低(P＜0.01)，且 VP1 蛋白組(2.27 ±0.21)明顯低于 pcDNA3/C3d3-sVP1 組(2.98 ±0.66)和 rAd/C3d3-sVP1組(2.93±0.14)，提示VP1蛋白能顯著降低受感染小鼠血中的病毒含量。

2.8 小鼠保護(hù)率 小鼠在接種CVB3第3天起開(kāi)始發(fā)病，第4天開(kāi)始死亡。各組21天生存率分別為:pcDNA3/C3d3-sVP1 組 33.33%，rAd/C3d3-sVP1組27.78%，VP1組66.67%，PBS組無(wú)生存。根據(jù)各組小鼠存活的情況(圖4)，用Kaplan-Meier生存分析表明，3種疫苗都能明顯提高對(duì)病毒攻擊后小鼠的保護(hù)率，但VP1蛋白組生存狀況優(yōu)于pcDNA3/C3d3-sVP1組和Ad/C3d3-sVP1組(P＜0.05)。

3 討論

C3d是補(bǔ)體C3不能水解的最小片段，能與B細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞細(xì)胞膜受體結(jié)合，促進(jìn)通過(guò)MHCⅡ類途徑的抗原提呈。本室前期將3個(gè)片段的C3d(C3d3)與帶有IL-2信號(hào)肽的CVB3VP1基因拼接，構(gòu)建靶向B細(xì)胞的分泌型核酸疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1。其后，又利用AdEasy系統(tǒng)，構(gòu)建包裝了重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1。本研究將這二種疫苗進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)末次免疫后rAd/C3d3-sVP1能誘導(dǎo)出較強(qiáng)的特異性IgG抗體和中和抗體以及較高水平的脾臟淋巴細(xì)胞特異性CTL殺傷活性，明顯高于質(zhì)粒載體疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1組，但致死量病毒攻擊后小鼠生存率卻沒(méi)有顯著提高。推測(cè)與腺病毒疫苗主要傾向于CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)［4］。當(dāng)致死量病毒攻擊小鼠后，未被中和的病毒感染心肌細(xì)胞后，較強(qiáng)的CTL殺傷活性會(huì)加重心肌損傷，導(dǎo)致 rAd/C3d3-sVP1組小鼠生存率降低。Schirmbeck等［5］曾將乙肝病毒s基因構(gòu)建到不同載體的疫苗免疫B淋巴細(xì)胞缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)腺病毒疫苗較核酸疫苗可以誘導(dǎo)更高更持久的CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng);Singh等［6］的研究也得出相同結(jié)論。T細(xì)胞分化的傾向?qū)π∈蟛《拘孕募⊙装l(fā)病起到很重要的作用，Henke等［7］研究發(fā)現(xiàn)用CVB3感染CD8+T細(xì)胞缺陷小鼠可以增加小鼠存活率，減少晚期嚴(yán)重病毒性心肌炎的發(fā)生，而感染CD4+T細(xì)胞缺陷小鼠雖發(fā)病時(shí)間推遲，但死亡率增加。故選擇合適的疫苗增強(qiáng)免疫后的體液免疫水平是CVB3疫苗的目標(biāo)。

亞單位疫苗是利用蛋白質(zhì)等抗原來(lái)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的，不含感染性組分，無(wú)須滅活，也無(wú)致病性。本研究將原核表達(dá)質(zhì)粒pET-his/VP1轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)CVB3 VP1蛋白，純化后免疫小鼠，結(jié)果顯示相對(duì)于另二種疫苗，VP1蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的特異性IgG抗體和中和抗體，顯著降低CVB3感染后小鼠血中病毒滴度，提高動(dòng)物存活率和存活時(shí)間;提示亞單位疫苗VP1蛋白可誘導(dǎo)出較強(qiáng)的體液免疫，而在保護(hù)小鼠免受致死量病毒的攻擊時(shí)體液免疫可能發(fā)揮更重要作用。最近一些研究顯示［8］，通過(guò)抑制Th1類細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)了體液免疫應(yīng)答，可明顯減輕CVB3感染小鼠的心肌炎癥，增加存活率。而Cihakova等［9］的研究從另一方面也得到類似的結(jié)論，通過(guò)敲除IL-4和IL-13基因的小鼠，減少了Th2類細(xì)胞因子產(chǎn)生，可導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞活化減少，加重CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎。

本研究中發(fā)現(xiàn)三種基因工程疫苗雖然均能不同程度提高小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，一定程度上保護(hù)免疫小鼠免受致死量CVB3攻擊，但VP1蛋白亞單位疫苗明顯優(yōu)于靶向基因疫苗，為進(jìn)一步研制高效預(yù)防CVB3感染的疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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