周 鷹 孫金霞 楊 李 王運(yùn)剛 馬桂芳 崔玉寶 (鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城224006)

傳統(tǒng)采用藥物治療Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，只能暫時緩解患者癥狀，而變應(yīng)原特異性免疫治療具有特異性、可根除疾病的優(yōu)點［1］。目前，臨床普遍使用變應(yīng)原粗提浸液混合物進(jìn)行免疫治療，其成分復(fù)雜，含有變應(yīng)原、非變應(yīng)原、甚至于毒性蛋白成分，因此臨床應(yīng)用會發(fā)生副反應(yīng)，嚴(yán)重者會威脅患者生命［2-4］。重組DNA技術(shù)為變應(yīng)原的生產(chǎn)提供了新的途徑，通過基因工程技術(shù)可以按照人類意志降低變應(yīng)原的致敏性。迄今，人們已經(jīng)獲得數(shù)百種重組變應(yīng)原，為過敏性疾病患者個體化診療提供了可能，重組變應(yīng)原用于皮下注射和舌下含服免疫治療過敏性疾病也進(jìn)入了臨床研究［5，6］。

國際免疫學(xué)會聯(lián)合會(WHO/IUIS，http://www.allergen.org)已命名了23組塵螨變應(yīng)原，了解這些變應(yīng)原組分的分子特征必將有助于臨床診斷和治療塵螨過敏性疾病。此外，已有報道多組變應(yīng)原組分存在多態(tài)性，并影響其臨床診斷和治療效果［7］。因此，有必要了解我國塵螨變應(yīng)原各組分的免疫生物學(xué)特征。本課題組采用基因工程技術(shù)先后獲得了粉塵螨變應(yīng)原第1至10組分的編碼基因，現(xiàn)將第10組分基因克隆表達(dá)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 EcoRⅠ酶、HindⅢ酶、TaKaRa RNAiso Reagent(Code No.D312)、High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa Code No.DR027A)、Prime-STAR?HSDNA(TaKaRa Code No.DR010A)、TaKa-Ra DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807)、TaKaRa DNA A-Tailing Kit(Code No.D404)、TaKaRa DNA Ligation Kit＜ Mighty Mix＞(Code No.D6023)、pMD19-T simple(Code No.D104)、E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、Protein marker 均購自大連寶生物公司。E.coli BL21(DE3)Stratagene公司生產(chǎn)。pET28a(+)(Kit Lot No.N72770)及Perfect protein marker由Novagen公司生產(chǎn)。Precision Plus Protein Standards購自Bio-Rad公司。True blue PEROXIDASE Substrate由Kirkegaard＆Perry Laboratories(KPL，Gaithersburg，MD)提供。Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(Code No.D9030A)、CBB-R250染色、PVDF膜、Western blot膜封閉液、CBB-R250染色液購自天根生化科技(北京)有限公司。Penta-His Antibody(BSA free)購自QIAGEN公司。HRP-Robbit Anti-Mouse IgG(H+L)購自ZYMED Laboratories公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。TP3000 PCR 儀(TaKaRa Bio Inc.)，Mupid電泳儀(Advance-Bio Co.，Ltd)，ImageMaster?VDS電泳成像裝置(Pharmacia Biotech)，ABI PRISMTM377XL DNA Sequencer DNA測序儀(Perkin Elmer)。

1.2 方法 解剖鏡下挑取粉塵螨(Dermatophagoides farinae)約600只，勻漿后用TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒提取總RNA，操作按說明書進(jìn)行。根據(jù)GenBank(EU 106617)公布的Der f 10 CDS區(qū)序列設(shè)計引物，并加入BamHⅠ/HindⅢ酶切位點，由寶生物工程(大連)有限公司合成如下:上游引物F:GC-3'，下游引物GTGGTGGTGCTCGAG-3'，下游引物R2:5'-GTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCATAACCAGTAA-3'。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)套式PCR擴(kuò)增出目的基因并克隆至pMD19-T simple載體測序，將測序正確的目的基因插入表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)，轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)表達(dá)，用 SDS-PAGE和 Western blot鑒定重組蛋白。

1.2.1 反轉(zhuǎn)錄 使用 High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Code No.DR027A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗，取Eppendorf管1支，依次加入總 RNA 1μl、各10 mmol/L dNTP Mixture 0.5 μl、20 μmol/L Random 6 mers 0.5 μl和RNase Free dH2O 3 μl，65℃水浴5 分鐘后，立即置冰上放置2分鐘，然后加入5×Prime-Script RT Buffer 2 μl、40 U/μl RNase Inhibitor 0.25 μl、PrimeScript RTase 0.5 μl、RNase Free dH2O 2.25 μl，置30℃ 10分鐘、42℃30分鐘、70℃15 分鐘進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2 套式PCR擴(kuò)增 Der f 10全長 cDNA 使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(Code No.DR010A)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積25μl，具體組成如下:上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl，5×Prime-STAR PCR Buffer 5 μl，各 2.5 mmol/L dNTP Mixture 2μl、10 μmol/L上游引物F 1 μl、10μmol/L下游引物 R21 μl、2.5 U/μl PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.25 μl、dH2O 13.75 μl。反應(yīng)條件:94℃變性2分鐘后，98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒條件下進(jìn)行30個循環(huán)，72℃ 5分鐘延伸。取上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR，反應(yīng)體積50μl，組成如下:上述PCR反應(yīng)液2 μl、5 ×PrimeSTAR PCR Buffer 10 μl、各2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μl、10 μmol/L上游引物F 1 μl、10 μmol/L 下游引物 R11 μl、2.5 U/μl Prime-STAR?HSDNA Polymerase 0.25 μl、dH2O 31.5 μl。反應(yīng)條件:94℃變性2分鐘后，98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒條件下進(jìn)行30個循環(huán)，72℃ 5分鐘延伸。取5μl PCR產(chǎn)物上樣電泳，觀察目的條帶。

1.2.3 克隆載體構(gòu)建、陽性克隆篩選及鑒定 回收上述PCR產(chǎn)物，加“A”尾、DNA精制后，將目的基因片段與pMD19-T Simple Vector(Code No.D104)連接后，熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài) E.coli JM109(Code No.D9052)，涂布于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取16個白色菌落，利用載體上的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳，含有目的條帶的菌落為陽性克隆菌。取陽性克隆菌置于含氨芐青霉素的TB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。取重組陽性克隆，提取質(zhì)粒，用 Bam HⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定pMD19-T-Der f 10，酶切反應(yīng)體積為 10 μl，組成為重組質(zhì)粒 1 μl、15 U/μl的BamHⅠ0.5 μl、15 U/μl的 Hind Ⅲ 0.5 μl、K Buffer 1 μl，dH2O 7 μl、37℃水浴30 分鐘，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段的大小。以重組質(zhì)粒DNA為模板，委托寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Der f 10的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ和HindⅢ對上述陽性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體積 50 μl，組成如下:約 200 ng/μl的pMD19-T-Der f 10 5 μl、10 × K Buffer 5 μl、15 U/μl BamHⅠ 1.5 μl、15 U/μl Hind Ⅲ1.5 μl、dH2O 37 μl，置37℃過夜，取5μl進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收得目的基因片段。用BamHⅠ和HindⅢ對pET28a(+)載體進(jìn)行酶切，反應(yīng)體積 50 μl，組成如下:約 100 ng/μl的 pET28a(+)10 μl、10 ×K Buffer 5 μl、15 U/μl BamHⅠ 1.5 μl、15 U/μl Hind Ⅲ1.5 μl、dH2O 32 μl，置 37℃ 過夜，取5μl進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收大片段，用TaKaRa DNA Ligation Kit將目的基因片段和pET28a(+)連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落，提取質(zhì)粒后行瓊脂糖凝膠電泳，對目的質(zhì)粒行BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，取10μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取pET28a(+)-Der f 10陽性克隆 0.5μl轉(zhuǎn)化 Competent cell BL21(DE3)100μl，涂布于 LB平板 (LB/抗生素 Kana為50μl/450μl)上，37℃搖菌過夜，以 pET28a(+)vector進(jìn)行同樣操作。次日挑取單菌落至2 ml LB/抗生素培養(yǎng)液中，37℃搖菌至OD600 nm值約為0.5 ～0.7，添加 IPTG 50 μl(final 1 mmol/L IPTG)，37℃誘導(dǎo)3小時后進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提，分別取各抽提液(全蛋白、上清可溶性蛋白、沉淀的不溶性蛋白)10 μl，加入 2.5 μl 5 ×SDSsample buffer，95℃加熱10 分鐘，12.5 μl(約0.05 OD)上樣進(jìn)行 SDSPAGE電泳，剩余樣品-80℃保存。電泳條件:20 mA/枚，90 分鐘，12%polyacrylamide gel，每孔加入5 μl TaKaRa protein marker(Broad)。電泳結(jié)束后，CBB-R250染40分鐘以上，使用脫色液脫色。

1.2.6 Western blot鑒定重組蛋白 按上述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按陽極、濾紙 A、濾紙 B、PVDF膜、PAGE Gel、濾紙 C、陰極順序進(jìn)行 Blot stack，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移(Semi-dry Blot)到 PVDF膜。再將PVDF 膜置 10 ml Blocking buffer(1.5%BSA、20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1%Tween 20)中，4℃平放過夜封閉。用 Blocking buffer按1∶1 000 稀釋一抗(Penta-His Antibody，BSA free，QIAGEN)，取5 ml抗體溶液置PVDF膜上靜置1小時，洗滌 Buffer(150 mmol/L NaCl，20 mmol/l Tris-HCl)+0.1%Tween(20 ml)洗滌2次，洗滌 Buffer沖洗3次。使用Blocking Buffer按1∶1 000稀釋二抗［HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)，ZYMED］，取稀釋后抗體溶液5 ml置PVDF膜上1小時，同上法洗滌，同前法洗滌去除多余的抗體，用1 ml True-Blue Peroxidase Substrate顯色1分鐘。將PVDF膜置于水中終止反應(yīng)。

1.3 生物信息學(xué)分析 將原始測序結(jié)果5'和3'端的酶切位點去除后，NCBI網(wǎng)站在線軟件進(jìn)行ORF分析。用Translate工具推導(dǎo)編碼氨基酸的序列及理化性質(zhì)，CELLO2.5軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位，F(xiàn)inger-PRINTScan分析其模序特點。

2 結(jié)果

2.1 粉塵螨變應(yīng)原Der f 10基因擴(kuò)增結(jié)果 RNAiso Reagent試劑盒提取粉塵螨總RNA后，根據(jù)Gen-Bank公布的Der f 10核酸序列設(shè)計并合成引物，RT-PCR擴(kuò)增獲得Der f 10，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，見一條約888 bp的條帶，與理論值相符合(具體見圖1)。

圖1 粉塵螨變應(yīng)原第10組分RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of the RT-PCR product of the group 10 allergen of Dermatophagoides farinae

2.2 克隆質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定結(jié)果 將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T simple連接后，轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109中，過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選并提取8個質(zhì)粒，用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定獲得與預(yù)期相符的結(jié)果，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒p MD 19-T-Der f 10雙酶切鑒定電泳圖Fig.2 Enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid p MD 19-T-Der f 10

圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Der f 10酶切鑒定Fig.3 The enzyme digestion analysis of the plasmids pET28a(+)-Der f 10

2.3 核酸序列測定 從酶切鑒定正確的8個質(zhì)粒中隨機(jī)挑取前5個質(zhì)粒，使用引物Primer pMD18F/Primer pMD18R對陽性重組質(zhì)粒測序，去除原始測序結(jié)果5'和3'端的酶切位點后，從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA共888 bp，與參考序列(Accession Number EU106617)比對，序列同源性高達(dá)99.8%，有2處發(fā)生堿基突變，依次位于57 bp(T→C)和429 bp(T→A)，但并不引起氨基酸變化。

2.4 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Der f 10的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切pMD 19-T-Der f 10，回收后獲得目的基因，將其插入pET28a(+)載體，質(zhì)粒提取后行瓊脂糖凝膠電泳，挑選目的質(zhì)粒用BamHⅠ/HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示出兩個條帶，與預(yù)期相符(見圖3)，說明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 粉塵螨變應(yīng)原第10組分原核表達(dá)及鑒定Fig.4 Expression of r Der f 10 in E.coli BL21 cells

2.5 重組變應(yīng)原rDer f 10的表達(dá)及鑒定 將pET28a(+)-Der f 10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21，測定得吸光度值為0.614，誘導(dǎo)表達(dá)后吸光度值為0.993，SDS-PAGE電泳時出現(xiàn)特異性條帶;Western blot分析表明重組蛋白可與抗His-Tag Mab抗體結(jié)合，也出現(xiàn)一特異性的反應(yīng)條帶，具體見圖4A、B。

2.6 氨基酸序列推導(dǎo)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測 由測序結(jié)果推導(dǎo)Der f 10全長cDNA由295個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為34 233.1 Da，摩爾消光系數(shù)(Molar extinction coefficient)5 960，等電點為 4.90;該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是44.71，表明該蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定;其親水性指數(shù)(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為 -1.063，表明其為疏水性蛋白。GOR4預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)包括 α-螺旋(271aa，91.86%)、延伸主鏈(4，1.36%)和無規(guī)卷曲(20，6.78%)，具體見圖5。將推導(dǎo)出來的氨基酸序列輸入FingerPRINTScan在線工具發(fā)現(xiàn)5個原肌球蛋白(Tropomyosin)模序，其分別位于 84～101、120～140、145～173、175～198和231～256氨基酸處。

3 討論

圖5 粉塵螨變應(yīng)原第10組分二級結(jié)構(gòu)分析(GOR4軟件)Fig.5 The secondary structure analysis of the group 10 allergen of Dermatophagoides farinae(GOR4 software)

特異性免疫治療被認(rèn)為是目前惟一的哮喘病因治療方法，可以提高患者對特異性變應(yīng)原的免疫耐受力，改變哮喘病程、阻滯癥狀的惡化和防治對新的變應(yīng)原產(chǎn)生過敏［2-4］。目前，臨床主要采用粉塵螨變應(yīng)原粗提浸液免疫治療哮喘患者，由于變應(yīng)原浸液包含成分較復(fù)雜，如存在變應(yīng)原、非過敏性或毒性蛋白及其它成分，所以很難進(jìn)行變應(yīng)原標(biāo)準(zhǔn)化，且在治療中長期使用易導(dǎo)致紅暈、腫脹、硬結(jié)、壞死等局部反應(yīng)和休克、喉頭水腫、支氣管痙攣、蕁麻疹、血管性水腫、全身性紅斑等全身反應(yīng)［2-4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和成熟，研制基因工程變應(yīng)原成為變態(tài)反應(yīng)學(xué)研究的主流。本次研究獲得了粉塵螨變應(yīng)原第10組分全長基因，并成功構(gòu)建其原核表達(dá)體系，為進(jìn)一步生產(chǎn)重組變應(yīng)原用于臨床診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。

隨著功能基因組、基因芯片和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)迅猛發(fā)展，生物信息學(xué)分析已成為變態(tài)反應(yīng)學(xué)研究的重要手段，尤其是用于變應(yīng)原結(jié)構(gòu)、模序及表位研究［8-10］。通過對Der f 10測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析，提示此變應(yīng)原由295個氨基酸組成的疏水性蛋白，相對分子質(zhì)量為34 233.1 Da。功能位點分析發(fā)現(xiàn)Der f 10含有5個原肌球蛋白位點，提示此變應(yīng)原與原肌球蛋白具有同源性。進(jìn)一步的分析顯示，其二級結(jié)構(gòu)包括 α-螺旋(91.86%)、延伸主鏈(1.36%)和無規(guī)卷曲(6.78%)。α-螺旋是指氨基酸鏈形成螺旋狀，4個氨基酸螺旋成一周，其在Der f 10二級結(jié)構(gòu)占有絕對優(yōu)勢，一定會對其三維結(jié)構(gòu)具有重要作用，并在其與IgE抗體結(jié)合反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因此有必要開展針對其二級結(jié)構(gòu)的后續(xù)研究。

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