李先平 王 敏 武 婷 梅 城 曹 虹 (中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科，長沙410011)

金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種腸毒素，作為超抗原，它可多克隆活化T細胞，誘發(fā)強烈的細胞免疫應(yīng)答［1］。我國開發(fā)的已用于腫瘤臨床治療的金葡液制劑，其有效成分被證明為 SEC［2］。其中 SEC 又分為 SEC1、SEC2、SEC3 3個亞型［3］。SEC 3個亞型的成熟蛋白氨基酸序列高度同源，在239個氨基酸中，SEC1與SEC2相似度為 97.2%，而 SEC1與 SEC3的相似度為97.1%［4］。3個亞型間序列的關(guān)聯(lián)決定了各亞型特異性抗原決定簇的關(guān)聯(lián)，尤其是其高度保守的羧基端決定了SEC的生物學(xué)活性和亞型間免疫交叉反應(yīng)的抗原決定簇。本課題組已將SEC3基因成功克隆到表達質(zhì)粒內(nèi)并實現(xiàn)了可溶性表達［5］，為進一步研究其生物學(xué)活性，本研究從rSEC3、刺激人外周血單個核細胞增殖情況和抑制腫瘤細胞生長這兩方面進行了觀察，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pET-32a(+)-SEC3復(fù)合DNA質(zhì)粒［5］、E.coli BL21菌株均為本課題組保存。PCR 試劑購自北京天根生化科技有限公司，PCR擴增引物(上游引物CCCT 3'，下游引物TTGTTGT 3')的合成和基因測序由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。150 bp DNA Ladder Marker購自大連寶生物工程公司;預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準(P7708)、IPTG購自 New England Biolabs公司。His-bind Ni2+親和層析柱購自美國Novogen公司。SEC單克隆抗體購自北京博邁世紀生物技術(shù)有限公司。羊抗鼠IgG購于美國PIERCE公司。人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品公司。RPMI1640細胞培養(yǎng)基，牛血清白蛋白(BSA)購自Gibco公司。四甲基偶氮噻唑藍(MTT)，植物血凝素(PHA)為美國Sigma公司產(chǎn)品。Hela細胞、KYSE細胞均由本院腫瘤中心提供。

1.2 主要儀器 JY 92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);PCR擴增儀為Gene-Amp PCR system 9700 Applied Biosystems;電泳儀為德國Biometra公司產(chǎn)品;Fluor Chem FC2凝膠數(shù)字圖像分析系統(tǒng)為Cell Biosciences公司產(chǎn)品;酶標儀為Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波長酶標儀。

1.3 rSEC3陽性菌的鑒定 將轉(zhuǎn)化有 pET-32a(+)-SEC3重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21接種于血平板，于37℃分純培養(yǎng)24小時之后挑取血平板上的單個菌落進行菌落PCR鑒定。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.4 rSEC3蛋白的誘導(dǎo)表達 將陽性菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至吸光度值(OD600)為0.6時，取出1 ml菌液并收集菌體，作為誘導(dǎo)表達前的對照。其余菌液中加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，4℃離心收集細菌沉淀。將細菌沉淀懸浮于緩沖液A(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲破碎使細菌裂解，4℃離心收集上清與細菌沉淀，沉淀再溶于含8 mol/L尿素的緩沖液A中，進行SDS-PAGE電泳。

1.5 SDS-PAGE電泳鑒定rSEC3蛋白的分子量配制12%的分離膠，5%的濃縮膠。取一定體積的菌液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸3～4分鐘。樣品冷卻后取20μl上樣。電泳:起始電壓90 V，待樣品在濃縮膠下緣濃縮成一條線后，加大電壓至140 V，等溴酚藍達到凝膠底部即可停止電泳。撬開兩層玻璃板，剝離凝膠至考馬斯亮藍染色液中，染色30分鐘～1小時。脫色至背景干凈，條帶清晰，凝膠成像儀拍照。

1.6 重組SEC3蛋白的純化和鑒定 取超聲裂解的上清液上樣至預(yù)平衡的Ni2+親和層析柱內(nèi)，用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH7.9)平衡至基線，洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，20 ～300 mmol/L 咪唑，pH 7.9)梯度洗脫，收集最后的洗脫液即為純化后的rSEC3蛋白。12%SDS-PAGE電泳分析樣品。SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)印至 PVDF膜上，經(jīng)過5%BSA封閉，PBST漂洗后，加入含抗 SEC抗體(1∶1 000稀釋)的 PBS，37℃反應(yīng)1小時，PBST漂洗，加入含HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)的PBS，溫育1小時，PBST洗膜后，增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)自顯影，洗片顯帶。

1.7 人外周血單個核細胞(PBMC)的分離 取健康成人外周血，加入抗凝劑后與等量Hanks液充分混勻，加入含淋巴細胞分離液的試管中(稀釋液與淋巴細胞分離液的比例為2∶1)，水平離心2 000 r/min×20分鐘。收集白膜層，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，每次2 000 r/min離心10分鐘，最后用完全培養(yǎng)基配成3×106ml-1的細胞懸液。

1.8 rSEC3對PBMC的促增殖作用 將PBMC懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1.5×105個細胞。加入終濃度分別為 0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/ml的rSEC3溶液(用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋)。每個濃度設(shè)3個平行孔。同時設(shè)終濃度為100μg/ml PHA的陽性對照及等體積培養(yǎng)基的空白對照。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每天取出震蕩混勻2次。培養(yǎng)至第68小時，每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl，混勻后繼續(xù)置培養(yǎng)箱中孵育4小時。取出后棄上清，每孔加200μl二甲亞砜(DMSO)溶解其中的藍紫色顆粒，震蕩混勻，置酶標儀上測定吸光值。測定波長570 nm，參考波長630 nm。

1.9 rSEC3的體外抑瘤活性 以PBMC為效應(yīng)細胞，Hela細胞和 KYSE細胞分別為靶細胞，測定rSEC3刺激效應(yīng)細胞后對靶細胞的殺傷作用。設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、靶細胞對照孔(含培養(yǎng)基和靶細胞)、效應(yīng)細胞本底釋放孔［含空白孔(含培養(yǎng)基、效應(yīng)細胞)、陽性對照孔(含培養(yǎng)基、效應(yīng)細胞、PHA)和實驗孔(含培養(yǎng)基、效應(yīng)細胞、3個不同濃度的rSEC3)］以及實驗孔(在上述效應(yīng)細胞本底釋放孔中分別對應(yīng)加入靶細胞)，每種設(shè)3個平行孔。其中PHA終濃度為100μg/ml，rSEC3終濃度分別為0.5、1、5μg/ml。效應(yīng)細胞本底釋放孔中細胞數(shù)為1.5 ×105/孔，實驗孔中每孔含 1.5 ×105個效應(yīng)細胞和1×104個靶細胞。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)44小時。吸收值測定方法同MTT法。按下式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=100-［(實驗孔-效應(yīng)細胞本底釋放孔)/靶細胞對照孔］×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析實驗數(shù)據(jù)。促淋巴細胞增殖實驗OD值、腫瘤細胞生長抑制實驗抑瘤率以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組菌的鑒定 觀察血平板上菌落生長情況，用SEC3的引物對隨機挑取的單個菌落進行菌落PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示有720 bp大小的條帶(圖1)。證明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至宿主菌。

2.2 rSEC3的純化和鑒定 轉(zhuǎn)化有pET-32a(+)-SEC3重組質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，超聲裂解菌體，上清純化液經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，純化后上清與純化前相比非特異性條帶明顯減少，說明純化效果好。純化后上清在相對分子質(zhì)量約47 kD處出現(xiàn)明顯的特異條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致。并且目的蛋白存在于超聲裂解液的上清中，表明重組SEC3蛋白是以可溶性蛋白的形式表達。

圖1 菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒Fig.1 Identification of recombinant plasmid with colony PCR

2.3 rSEC3的Western blot鑒定 免疫印跡結(jié)果顯示，重組SEC3蛋白能被抗SEC抗體識別，說明重組SEC3蛋白具有良好的抗原性(圖3)。

2.4 rSEC3對PBMC的促增殖作用 用終濃度分別為 0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/ml的 rSEC3 作用PBMC，37°C、5%CO2條件下培養(yǎng) 68 小時后，MTT法測定吸光度值(見圖4)?？瞻讓φ諡榈润w積RPMI1640培養(yǎng)基，陽性對照為100μg/ml PHA。用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析結(jié)果得知:與空白對照相比，0.1～100μg/ml的 rSEC3對 PBMC均有顯著的促增殖作用(P＜0.05);且濃度為1μg/ml時，促增殖作用最強(OD 值為 0.388 ±0.003，t=113.851，P=0.000);和 100μg/ml的 PHA作用相似(t=0.693，P=0.527)。

2.5 rSEC3刺激PBMC后對Hela細胞、KYSE細胞的抑制作用 用MTT法觀察終濃度分別為0.5、1、5 μg/ml的rSEC3刺激PBMC后對Hela細胞和KYSE細胞的抑制作用結(jié)果見圖5?？瞻讓φ諡榈润w積培養(yǎng)基，陽性對照為100μg/ml PHA。結(jié)果用SPSS17.0軟件分析，以Hela細胞為靶細胞，與空白對照相比，0.5、1、5 μg/ml的 rSEC3 均有顯著的抑瘤作用(P ＜0.05);rSEC3濃度為5μg/ml時抑制作用最強［抑瘤率為(103.40 ± 6.65)%，t=10.25，P=0.000］。以KYSE細胞為靶細胞，與空白對照相比，3個濃度的rSEC3也都有顯著的抑瘤作用(P＜0.05);且rSEC3濃度為1μg/ml時抑制作用最強，抑瘤率為［(46.62 ±4.17)%，t=20.96，P=0.000］。

圖2 SEC3重組蛋白大量表達的SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant SEC3 using SDSPAGE

圖3 重組SEC3蛋白的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of recombinant SEC3 protein

圖4 不同濃度的r SEC3對PBMC的促增殖作用Fig.4 Proliferation of PBMC by different concentration of recombinant SEC3

圖5 r SEC3作用PBMC后對Hela細胞、KYSE細胞的抑制作用Fig.5 Anti-tumor activity of recombinant SEC3 by activating PBMC

3 討論

金黃色葡萄球菌腸毒素是由金黃色葡萄球菌分泌的一種細菌性超抗原，具有多種生物學(xué)活性［6-8］。超抗原可直接與MHCⅡ類分子及TCR-β鏈的V區(qū)結(jié)合，選擇性地大量擴增和激活T細胞，激活的T細胞能對表達MHCⅡ類分子的靶細胞產(chǎn)生細胞毒作用［9］。與此同時還能誘導(dǎo)腫瘤敏感性細胞因子如 IFN-γ、TNF-α、IL-2 的產(chǎn)生，從而達到間接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤生長的作用［10］。與普通抗原相比，超抗原不需APC的處理，亦不受MHCⅡ類分子的限制，又由于Vβ基因的多態(tài)性，針對某一特定的超抗原，在T細胞庫中約有2% ～30%細胞可發(fā)生反應(yīng)。因此，腸毒素作為超抗原是一種極好的免疫調(diào)節(jié)劑和細胞因子誘導(dǎo)劑，成為潛在的腫瘤免疫治療藥物［11］，也成為免疫學(xué)研究的一個重要方向。

由于天然腸毒素產(chǎn)量低，純化困難，近年來融合蛋白表達系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于重組腸毒素蛋白的制備。目前，已有多種腸毒素蛋白實現(xiàn)重組表達并完成了生物學(xué)活性實驗［12-15］。本課題組研究構(gòu)建了SEC3基因的表達載體并實現(xiàn)了重組SEC3蛋白的可溶性表達。SEC3與MHCⅡ類分子作用的關(guān)鍵氨基酸殘基為43～47位［16］，野生型SEC3由275個氨基酸組成，分子量約為31.4 kD，而重組的SEC3蛋白由239個氨基酸組成，分子量27.6 kD，由于添加了Trx，S，His編碼序列，因此產(chǎn)物是一融合蛋白，分子量約47 kD。通過Swiss-PdbViewer軟件分析發(fā)現(xiàn)改變的氨基酸對SEC3的生物學(xué)活性影響較小。

PBMC主要含T、B淋巴細胞、NK細胞和單核細胞，超抗原可在B細胞和單核細胞的輔助下激活表達相應(yīng)TCR-Vβ的T細胞，使大量的CD4+、CD8+T細胞被活化。在余德厚等［17］對SEA的研究中，發(fā)現(xiàn)SEA濃度為1μg/ml時，T細胞表現(xiàn)了最大的增殖活性，但細胞增殖活性與SEA濃度無正相關(guān)性。李明等人［18］對 SEB的研究發(fā)現(xiàn)，在0～1μg/ml的劑量范圍內(nèi)，SEB促T細胞增殖活性的差異無顯著性。本實驗中，我們采用 MTT法檢測 rSEC3對PBMC的促增殖作用，結(jié)果顯示在1μg/ml時，rSEC3對T細胞產(chǎn)生了最大的促增殖作用，但隨著rSEC3濃度的增加，T細胞增殖活性并未增加。以上研究結(jié)果均表明，腸毒素SEC3濃度與T細胞的增殖無正相關(guān)性。

在體外抑瘤實驗中，0.5、1、5 μg/ml的 rSEC3均能顯著增強淋巴細胞對Hela細胞和KYSE細胞的殺傷活性。但對Hela細胞的抑瘤率總體高于KYSE細胞，這可能是由于針對不同的腫瘤細胞，rSEC3發(fā)揮殺傷作用的主要機制不同［19-21］。以Hela細胞為靶細胞時，5μg/ml rSEC3作用淋巴細胞后抑瘤率超過100%，在重組SEC2的研究中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果［14］。抑瘤率超過100%即實驗孔的吸光度值小于效應(yīng)細胞本底釋放孔，說明測定時實驗孔內(nèi)活細胞數(shù)量小于效應(yīng)細胞本底釋放孔。這可能因為在免疫應(yīng)答晚期，由于大量腫瘤細胞被清除，淋巴細胞所接受的抗原刺激及所產(chǎn)生的生長因子均減少，導(dǎo)致胞內(nèi)線粒體釋放細胞色素C，通過caspase級聯(lián)反應(yīng)而致細胞凋亡［22］。

另外，本研究中當rSEC3濃度為1.0μg/ml時，促T細胞增殖作用最強;據(jù)此推斷，在1μg/ml時抑瘤活性也應(yīng)該最高。以KYSE細胞為靶細胞時確實如此，但以Hela細胞為靶細胞時，抑瘤活性最高的濃度為5μg/ml，與促T細胞增殖實驗結(jié)果并不平行。這可能是由于rSEC3發(fā)揮抑瘤活性包含多種機制，除了促進T細胞增殖外，還能夠促進淋巴細胞分泌細胞因子;且IFN-γ、IL-2等多種細胞因子能夠強化NK細胞的殺傷力度，使原先對NK細胞有耐受性的腫瘤細胞也被殺傷［19-21］。因此促T細胞增殖活性最高的濃度未必就是抑瘤活性最高的濃度。

本研究中通過檢測rSEC3的超抗原活性，結(jié)果表明，rSEC3能有效刺激PBMC增殖，并顯著增強PBMC對Hela細胞、KYSE細胞的殺傷作用。另外，本研究還將金黃色葡萄球菌CMCCB(26002)進行了產(chǎn)毒培養(yǎng)，將粗提的腸毒素蛋白(SEs)與rSEC3進行比較，發(fā)現(xiàn)rSEC3的超抗原活性優(yōu)于粗提腸毒素蛋白(結(jié)果另發(fā))。

綜上，本研究成功表達并純化了重組SEC3蛋白，且rSEC3蛋白具有典型的超抗原活性。為進一步制備單克隆抗體，構(gòu)建靶向抗腫瘤融合蛋白奠定了基礎(chǔ)。

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