李宏彬 徐光翠 桂立輝 馮憲軍 趙 兵 席景磚 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)系，新鄉(xiāng)453003)

哮喘是兒童最常見(jiàn)的一種慢性呼吸道炎性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制涉及到機(jī)體免疫、遺傳、神經(jīng)和環(huán)境等諸多方面［1］。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在引起哮喘的眾多因素中，遺傳可能是最為重要的因素。TGF-β1基因是一種具有多功能生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝、參與炎性反應(yīng)、間質(zhì)纖維化和抑制免疫監(jiān)視等方面起重要作用［2，3］。分子生物學(xué)研究表明，TGF-β1基因存在多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)參與哮喘的發(fā)生，但確切機(jī)制尚不明了［4］。ADAM33是首個(gè)通過(guò)定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因［5］，位于人類(lèi)染色體 20p13，至少包含70個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，研究表明該基因具有高度多態(tài)性，在不同的種族，與哮喘的發(fā)生以及氣道高反應(yīng)性有顯著相關(guān)［6］。目前有關(guān)TGF-β1和ADAM33基因交互作用與漢族兒童哮喘易感性研究尚少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照方法，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，檢測(cè)對(duì)照組和病例組兒童TGF-β1基因T869C位點(diǎn)和 ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，從遺傳流行病學(xué)角度探討兩基因的單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphisms，SNPs)與漢族兒童哮喘易感性及嚴(yán)重程度的關(guān)系，為篩選哮喘的高危人群提供分子流行病學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2008年3月至2010年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科和兒科住院及門(mén)診患兒110例，男61例，女49例，年齡3.1～14.6歲，符合全球哮喘防治創(chuàng)議的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，其中輕中度哮喘63例和重度哮喘47例。同時(shí)選擇同期住院非呼吸系統(tǒng)疾病患者144例為對(duì)照組，對(duì)照均無(wú)個(gè)人及家族哮喘史和過(guò)敏史(包括濕疹、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎)。病例組和對(duì)照組間性別構(gòu)成和平均年齡均無(wú)差異，所有研究對(duì)象均為來(lái)自豫北地區(qū)(河南省黃河以北5市)的漢族兒童，并由家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人簽署《知情同意書(shū)》。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝管采集受檢者外周靜脈血2 ml放置-80℃冰箱備用。DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司，所有操作步驟均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 基因型檢測(cè) 通過(guò)GenBank查找到編號(hào)為rs1982073、rs2787094和rs2280090基因完整序列，采用 Primer premier 5軟件包設(shè)計(jì) TGF-β1基因T869C位點(diǎn)和ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)引物，設(shè)計(jì)的引物由上海生物工程有限公司合成。三位點(diǎn)的引物及PCR反應(yīng)退火溫度、產(chǎn)物長(zhǎng)度及酶切片段見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)總體積 25 μl，其中 10 × Buffer 2.5 μl，TaqDNA 聚合酶 0.7 U，dNTP 2.5 μl，上下游引物各1 μl，Template DNA 1.5 μl，25 mmol/L MgCl21.8 μl，雙蒸水14 μl;PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5分鐘;95℃變性30秒，一定的退火溫度30秒，72℃延伸40秒，共35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10分鐘，最后4℃保存。取10 μl PCR產(chǎn)物，建立總體積為30 μl的酶切反應(yīng)體系，加入相應(yīng)的限制性酶 Pst I、Hinf I和PvuⅡ(fermentas基因公司)，37℃溫育4小時(shí)，65℃水浴15分鐘終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5 μg/ml)電泳分離，經(jīng)凝膠成像儀系統(tǒng)處理后進(jìn)行基因型判讀，記錄并保存結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為考察研究資料的可靠性，所有位點(diǎn)每組分別進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。組間基因型頻率和等位基因頻率的差異性比較采用χ2檢驗(yàn)。基因多態(tài)性與哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)程度采用比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)描述。采用MDR(version 1.1.0)軟件分析SNP間交互作用。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 三位點(diǎn)在各組的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明本次抽樣具有代表性。TGF-β1基因T869C位點(diǎn)對(duì)照組(χ2=0.033，P=0.402)，病例組(χ2=1.584，P=0.856);ADAM33基因 V4位點(diǎn)對(duì)照組(χ2=0.823，P=0.396)，病例組(χ2=0．036，P=0.849);T2位點(diǎn)對(duì)照組(χ2=0．703，P=0.402)，病例組(χ2=1．584，P=0.208)。

2.2 TGF-β1和ADAM33基因多態(tài)性位點(diǎn)與兒童哮喘相關(guān)性分析 由表2可見(jiàn)，T869C多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在哮喘各組與對(duì)照組之間的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哮喘各組中V4位點(diǎn)C等位基因頻率均高于對(duì)照組(P＜0.01)，C等位基因攜帶者患哮喘的危險(xiǎn)性是G等位基因的2.36倍(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56)，T2位點(diǎn) A 等位基因頻率在哮喘各組中的分布均高于對(duì)照組(P＜0.01)，A等位基因攜帶者患哮喘的危險(xiǎn)性是G等位基因的2.96倍(OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。V4位點(diǎn)CC基因型分布在對(duì)照組與輕中度哮喘組無(wú)差異外，余在各組中分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);T2位點(diǎn)除GA基因型分布在對(duì)照組與輕中度哮喘組、AA基因型分布在對(duì)照組與重度哮喘組無(wú)差異外(P=0.084、0.063)，其余在各組中分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 候選多態(tài)性位點(diǎn)的引物、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度及酶切片段Tab．1 Candidate polymorphisms，polymerase chain reaction(PCR)，Annealing temperature，PCR product sizes，restriction enzymes and digested fragment size

2.3 多態(tài)性位點(diǎn)之間的MDR交互作用分析 將數(shù)據(jù)進(jìn)行交互作用分析，目的在于找出與兒童哮喘發(fā)病顯著相關(guān)的基因與基因的交互作用，在一至三階模型中發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)最佳模型僅包含ADAM33基因位點(diǎn)V4和T2;3個(gè)位點(diǎn)最佳模型包括了T869C、V4和T2。兩模型哮喘組和對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，交叉驗(yàn)證一致率均為100%。見(jiàn)表3，模型的單元格劃分及組合情況見(jiàn)圖1。

表2 ADAM33和TGF-β1基因型及等位基因頻率在對(duì)照組與哮喘組、不同程度哮喘組的分布Tab．2 Distribution of genotype and allele frequencies for ADAM33 and TGF-β1 between controls(CTR)and total patients with asthma(TA)，patients with moderate asthma(MA)，and patients with severe asthma(SA)

表3 ADAM33和TGF-β1基因交互作用的MDR模型Tab．3 MDR models of the interaction between ADAM33 and TGF-β1 gene SNPs

圖1 ADAM33和TGF-β1基因多態(tài)性位點(diǎn)交互作用的圖解模型Fig．1 Graphical representation of the interaction between ADAM33 and TGF-β1 gene SNPs

3 討論

ADAM33是2002年首個(gè)通過(guò)定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因，因其與支氣管哮喘密切相關(guān)而成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。先后多個(gè)研究小組對(duì)不同種族人群ADAM33基因單核酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，而研究結(jié)果不盡一致，Qu等［8］研究表明 ADAM33基因的T+1、T1、V4可能參與了中國(guó)北方漢族兒童哮喘的發(fā)病過(guò)程。Nallur等［9］則在印第安人群進(jìn)行的一個(gè)病例對(duì)照研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ADAM33基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關(guān)性?；谙诰哂胁煌z傳背景的人群中可能存在不同的哮喘易感基因與各種環(huán)境因素作用而導(dǎo)致哮喘發(fā)生，本研究選擇ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)探討中國(guó)豫北地區(qū)漢族兒童該基因多態(tài)性和哮喘病的關(guān)系。

本組資料結(jié)果顯示，哮喘組ADAM33基因V4位點(diǎn)C等位基因和T2位點(diǎn)A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，提示C、A等位基因可能增加兒童哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56;OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。將哮喘患兒分為輕中度和重度對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘組V4位點(diǎn)CC基因型頻率高于對(duì)照組，輕中度和重度哮喘組GC基因型頻率高于對(duì)照組，表明C等位基因可能同時(shí)影響兒童哮喘發(fā)病嚴(yán)重程度，當(dāng)然也有學(xué)者得出不同的結(jié)論［10］，究其原因可能與種族、樣本量大小及環(huán)境暴露因素有關(guān)。結(jié)果還顯示T2位點(diǎn)GA基因型僅與重度哮喘有關(guān)，AA基因型僅與輕中度哮喘有關(guān)，而GG基因型可能使哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，這與Jie等［11］的研究相一致。本資料提示V4、T2位點(diǎn)多態(tài)性不僅與豫北地區(qū)漢族兒童哮喘的發(fā)生有關(guān)而且影響哮喘嚴(yán)重程度。

TGF-β1基因T869C位點(diǎn)C置換T后導(dǎo)致蛋白質(zhì)第10號(hào)位置的氨基酸由亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，進(jìn)而影響到TGF-β1的分泌和表達(dá)。文獻(xiàn)資料顯示，TGF-β1能調(diào)節(jié)氣道炎癥和加速氣道重塑，增加氣道阻力，影響哮喘發(fā)病過(guò)程［12］。也有研究得出相反的結(jié)論，Wisniewski等［13］就未發(fā)現(xiàn)T869C與波蘭人哮喘病的發(fā)生有關(guān)。本組資料顯示T869C位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在哮喘各組與對(duì)照組間均無(wú)差異，這表明該多態(tài)性位點(diǎn)與豫北地區(qū)漢族兒童哮喘的發(fā)生及其嚴(yán)重程度無(wú)明顯相關(guān)性。

基因-基因交互作用分析是目前遺傳流行病學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，MDR方法作為一種非參數(shù)、不受遺傳模式影響的分析方法，被成功用于分析多因素相關(guān)的復(fù)雜疾病研究。雖然 TGF-β1基因T869C位點(diǎn)基因型在哮喘組和對(duì)照組之間分布無(wú)差異，經(jīng)過(guò)MDR分析提示，ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)與TGF-β1位點(diǎn) T869C具有明顯交互作用，推測(cè)V4、T2、T869C三位點(diǎn)對(duì)哮喘發(fā)病可能具有累計(jì)效應(yīng)。哮喘是一種多基因遺傳疾病，發(fā)病機(jī)制涉及多條生化通路，單個(gè)基因或位點(diǎn)在其發(fā)病中的作用難以得到證實(shí)，同時(shí)針對(duì)多基因多位點(diǎn)的研究可能更具有意義。

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