陳 巖 綜述 秦陽華 沈 茜 審校 (第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院實驗診斷科，上海200433)

高遷移率族蛋白1(High Mobility Group box 1，HMGB1)是一種非組蛋白核蛋白，在許多疾病中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有越來越多的研究表明HMGB1蛋白第106位點上半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)與其功能特性密切相關(guān)。

1 HMGB1的結(jié)構(gòu)與功能

高遷移率蛋白(High Mobility Group，HMG)是一組非組蛋白核蛋白，廣泛表達于真核生物細胞中，早于20世紀60年代由細胞核中提純獲得，經(jīng)過幾十年的發(fā)展又分為幾大家族，高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)是HMG超家族中的一員。

HMGB1是一種在大多數(shù)真核細胞中表達豐富(106分子/細胞)、高度保守的非組蛋白核蛋白，由215個氨基酸組成。哺乳動物的HMGB1有98.5%氨基酸序列具有同源性，在細胞內(nèi)外發(fā)揮著不同功能。近來許多實驗表明其23、45和106位點上的半胱氨酸殘基，尤其是106位點上的半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)對HMGB1的功能有重要影響。HMGB1包含兩個帶正電的DNA結(jié)合域:A盒與B盒和一個帶負電的酸性羧基端(圖1)［1］。

HMGB1是由215個氨基酸殘基組成的25 kD的蛋白質(zhì)，其中超過20%為賴氨酸，由3個獨特的結(jié)構(gòu)域組成，分別為兩個負電的DNA結(jié)合域(A盒，B盒)，一個帶正電的羧基端(由30個谷氨酸和天門冬氨酸組成)，其中A-box位于N末端，進化高度保守;C-tail在羧基末端，包含30個重復的天冬氨酸和谷氨酸殘基，可參與調(diào)節(jié)HMGB1與DNA結(jié)合的親和力，B-box位于兩者之間。A-box和B-box均由3個螺旋組成，并帶有強烈的正電荷，構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合域。HMGB1釋放至胞外后主要由B-box發(fā)揮促炎功能，A-box對B-box有拮抗作用，而B-box中的106位點在HMGB1發(fā)揮促炎作用時起了重要作用，當106位點被氧化HMGB1就喪失了促炎活性。

HMGB1是一種具有雙功能的警報蛋白，可以啟動天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，參與多種疾病過程。然而，其功能尚未完全明確;研究者發(fā)現(xiàn)在細胞核內(nèi)和在細胞外HMGB1發(fā)揮著不同的生物學效應(yīng)。在細胞核內(nèi)，HMGB1的DNA結(jié)合域與DNA的雙螺旋小溝結(jié)合引起了DNA的構(gòu)象變化，并參與DNA的轉(zhuǎn)錄、修復、復制及核小體的穩(wěn)定;一旦釋放到細胞外，就會作為細胞因子激活炎癥細胞產(chǎn)生促炎細胞因子如 TNF-α、IL-1 和 IL-8 等［2］;從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿的HMGB1參與了細胞自噬的調(diào)節(jié)［3］。較早的研究者認為HMGB1的促炎活性是通過與高度糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advance glycation end products，RAGE)結(jié)合實現(xiàn)的，因RAGE基因缺陷的小鼠其巨噬細胞被HMGB1刺激產(chǎn)生促炎細胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)的能力大大下降。RAGE是第一個被發(fā)現(xiàn)的HMGB1的受體，表達在單核-巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞［4］。通過RAGE刺激下游的Cdc42與Rac，HMGB1可以介導趨化作用、參與細胞生長、免疫細胞的分化、平滑肌細胞及免疫細胞的遷移［5-8］。腫瘤細胞內(nèi)的 HMGB1也是通過與RAGE的結(jié)合激活細胞內(nèi)的p38MAPK和Racl，并通過激活細胞外ERK、JNK、AKT等信號促進腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和誘導腫瘤的血管形成的［9］。隨著研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)HMGB1的促炎活性主要是與 Toll樣受體(TLR)4有關(guān)。Yang等［10］用TLR2、TLR4基因缺陷小鼠和正常小鼠的腹膜巨噬細胞經(jīng)HMGB1刺激后，發(fā)現(xiàn)TLR4缺陷的巨噬細胞不能產(chǎn)生TNF-α，IL-1β和IL-6的產(chǎn)生也大大下降，說明TLR4在HMGB1促免疫細胞釋放促炎細胞因子中是必需的。除了參與促炎細胞因子的釋放外，HMGB1與樹突狀細胞表達的TLR4結(jié)合在腫瘤的放、化療后抗腫瘤免疫反應(yīng)中起積極作用，TLR4基因突變的乳腺癌病人放療、化療后腫瘤復發(fā)的速度較 TLR4基因功能正常的病人快［11］。當HMGB1與寡核苷酸結(jié)合形成復合物后就能與另外一個受體TLR9交互作用，在肝臟缺血再灌注損傷中產(chǎn)生病理損傷效應(yīng)［12］。有研究表明HMGB1與一些促炎細胞因子(如IL-1β、IL-6)和細菌產(chǎn)物LPS共孵育后產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，誘導生成的促炎細胞因子濃度是 HMGB1單獨刺激產(chǎn)生的 10倍［13］。Qin等［14］發(fā)現(xiàn)用HMGB1增強了LPS刺激小鼠腹膜巨噬細胞產(chǎn)生促炎細胞因子的能力，但這種結(jié)合是有選擇性的，原因尚未闡明。在一些炎癥疾病中HMGB1的釋放促進促炎細胞釋放更多的促炎細胞因子，這些促炎細胞因子又會進一步促進HMGB1的釋放，產(chǎn)生正反饋循環(huán)加劇了疾病的發(fā)生和發(fā)展。

2 HMGB1的氧化還原狀態(tài)對其功能的影響

HMGB1的三級結(jié)構(gòu)顯示23和45位的半胱氨酸殘基在空間上是反向的，且暴露在分子表面易于受氧化劑的影響形成交聯(lián)的二硫鍵，而106位點隱藏于HMGB1 L型溝槽內(nèi)，不參與HMGB1氧化還原依賴的構(gòu)象變化。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變會影響蛋白質(zhì)的功能，外環(huán)境氧化還原狀態(tài)的改變會影響HMGB1的空間構(gòu)象從而影響了HMGB1的功能。

還原狀態(tài)時的HMGB1三個位點上的殘基均為還原狀態(tài)，在氧化條件下23和45位的半胱氨酸殘基交聯(lián)形成二硫鍵，106位點亦被氧化，此時的HMGB1喪失了免疫活性。然而，在輕微的氧化環(huán)境中雖然23和45位點上的半胱氨酸殘基被氧化，106位點上的半胱氨酸卻仍處于還原狀態(tài)時可以刺激炎癥的發(fā)生。Hoppe等［15］利用定點突變技術(shù)將HMGB1氨基酸序列的23、45和106位點單獨或聯(lián)合突變?yōu)榻z氨酸，破壞了二硫鍵的形成。突變體轉(zhuǎn)染細胞后發(fā)現(xiàn)23、45單獨或聯(lián)合突變或三個位點均突變產(chǎn)生的HMGB1均為還原狀態(tài)，且單獨或聯(lián)合將23、45位點突變后并不影響HMGB1在細胞核內(nèi)的分布，而106位點半胱氨酸殘基突變的HMGB1主要表達在胞漿。在此基礎(chǔ)上 Tang等［3］發(fā)現(xiàn)HMGB1 106位點半胱氨酸突變成亮氨酸后自噬標記物LC3的量也增加了，由此可見106位點不僅對于HMGB1在胞漿到胞核之間的穿梭起重要作用，更參與了自噬的調(diào)節(jié)。106位點半胱氨酸殘基氧化還原狀態(tài)的改變不僅僅影響了HMGB1在細胞內(nèi)的分布，106位上半胱氨酸替換成賴氨酸的重組HMGB1蛋白不能與TLR4/MD2結(jié)合，不能介導刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α。為了進一步確認此位點在這一過程中的重要性，人工合成了包含B盒前20個氨基酸的肽段(89～108位點，TLR4結(jié)合位點)，其106位點上的半胱氨酸替換成絲氨酸后，這一肽段也不能刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α［10］。先前的研究者認為凋亡細胞產(chǎn)生HMGB1的量較少、且與DNA結(jié)合較緊密，故不能激活免疫系統(tǒng)。Urbonaviciute等［16］在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，在細胞死亡過程中HMGB1半胱氨酸殘基經(jīng)歷了可逆的氧化修飾，從而喪失了免疫活性。將3種不同位置突變的重組HMGB1加入與凋亡細胞共孵育的樹突狀細胞、再加入氧化劑H2O2后發(fā)現(xiàn):106位點突變后的HMGB1能夠阻止由凋亡細胞誘導的免疫耐受的產(chǎn)生，維持了免疫原性［17］。總之，HMGB1通過 TLR4誘導細胞因子產(chǎn)生的過程中，106位點上的半胱氨酸扮演了重要角色。

圖1 HMGB1的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of human HMGB1

3 HMGB1的氧化還原狀態(tài)與自噬

自噬是一個動態(tài)復雜的過程，在細胞受到損傷時從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬所起的作用是正面還是負面的，尚未完全闡明。Tang等［18］對HMGB1進行研究時發(fā)現(xiàn)HMGB1的釋放在細胞的凋亡與自噬的發(fā)生中起到了交叉調(diào)節(jié)的作用，決定了細胞死亡或生存。這個概念延伸到抗腫瘤治療時HMGB1既可以參與腫瘤細胞的增殖、浸潤、遷移，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展;又可以通過TLR誘導T淋巴細胞的活化，發(fā)揮抗腫瘤的作用。在腫瘤的放射治療過程中，腫瘤細胞釋放的大量活性氧(ROS)氧化了HMGB1的半胱氨酸殘基，使HMGB1喪失了免疫活性，誘導機體對腫瘤抗原免疫耐受的形成。放射治療和一些細胞毒藥物在刺激腫瘤細胞凋亡的同時也使細胞產(chǎn)生了自噬，Liu等［19］發(fā)現(xiàn)在白血病細胞系HL-60細胞中加入外源性HMGB1后自噬增加了，也降低了腫瘤細胞對藥物的敏感性，這種類似于“棄車保帥”的行為使腫瘤細胞逃避藥物的作用。同時HMGB1大量釋放又促進自噬的發(fā)生，該作用充當了促細胞存活信號的角色，降低了抗腫瘤治療的效果。對于自噬通路的研究，Kang等［20］發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)的HMGB1與Bcl-2競爭性結(jié)合Bcline-1，在調(diào)節(jié)自噬溶酶體形成過程中起到了重要作用。然而釋放到細胞外的HMGB1在調(diào)節(jié)自噬的產(chǎn)生時受自身氧化還原狀態(tài)的影響，其中106位點狀態(tài)不同的HMGB1在抗腫瘤治療過程中所起作用亦不同。Tang等［18］使用兩種不同狀態(tài)的 HMGB1(23和45位點半胱氨酸殘基交聯(lián)成二硫鍵，只在106位點氧化還原狀態(tài)不同)進行研究發(fā)現(xiàn):在人結(jié)腸癌細胞和胰腺癌細胞中使用還原型 HMGB1，可通過與RAGE結(jié)合促發(fā)了Bcline-1依賴的自噬，促進了腫瘤細胞對細胞毒藥物的抵抗;而氧化型HMGB1則增加了這些藥物的細胞毒性及與此引發(fā)的caspase-9/-3通路介導的凋亡。這些現(xiàn)象讓我們思考能否有種方法使 HMGB1能夠保持免疫活性，Kazama等［17］利用定點突變技術(shù)將易被氧化的第23、45、106位點半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，此突變體不會被細胞間氧氧化，既保留了免疫原性又可激活樹突狀細胞引起T淋巴細胞介導的免疫應(yīng)答。我們認為可以將HMGB1的這一特性、結(jié)合傳統(tǒng)的治療方法，可能為腫瘤的治療找到一個新靶點。

4 展望

雖然抗HMGB1治療在許多疾病中都取得了不錯的效果，但是HMGB1釋放抑制劑不能產(chǎn)生特異性效果，而抗HMGB1抗體在應(yīng)用于人體時需人源化，否則會產(chǎn)生人抗異源性抗體反應(yīng)。同時，在腫瘤治療過程中HMGB1的不同狀態(tài)也會產(chǎn)生不同的效果。鑒于此，我們認為可以通過制備HMGB1的突變體，在炎癥反應(yīng)時此突變體會與受體結(jié)合，通過競爭性抑制內(nèi)源性HMGB1與受體的結(jié)合、而不產(chǎn)生炎癥效應(yīng)，又不影響其他分子的作用。在腫瘤治療過程中，制備的突變體可以避免HMGB1重要位點的氧化，保持其免疫活性，提高治療效果和特異性。

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