林東紅 崔兆磊 孔令英 林振興 胡建達(dá) (福建醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)系，福州350004)

舒尼替尼(SU11248)，全稱蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)，商品名索坦(Sutent)，是美國輝瑞(Pfizer)公司推出的一種新型多靶點(diǎn)血管生成抑制劑。2006年1月獲得FDA批準(zhǔn)上市。該藥作為分子靶向藥物用于惡性腫瘤的治療，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。其通過靶向性抑制多種酪氨酸激酶和生長因子受體，阻斷多種信號通路，而起到抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖的作用。臨床研究表明，該藥具有廣譜的抗腫瘤活性，尤其對腎細(xì)胞癌、胃腸道間質(zhì)瘤、乳腺癌等實體性腫瘤具有良好的抑制效果。本實驗擬研究SU11248對慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞的作用，探究相關(guān)分子機(jī)制，為該藥作為抗腫瘤新藥應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購自Hyclone公司。SU11248購自Biocompound公司，溶解于二甲亞砜(Dimethylsulfoxide)，-20℃避光保存。CCK-8試劑盒為日本同仁產(chǎn)品。細(xì)胞周期試劑盒購自南京凱基。兔抗人Bcl-2、Bax單抗及鼠抗人p73單抗購自Abcam公司，兔抗人Caspase-3、Caspase-9多抗及鼠抗人p53單抗購自Santa Cruz公司。DAPI染液、免疫熒光染色試劑盒、兔抗人NF-κB p65單抗、鼠抗人Cyto C、β-actin單抗購自江蘇碧云天。

1.1.2 細(xì)胞株 人慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，由福建省血液研究所傳代保存。用含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2溫箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3天換液傳代1次。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8比色法檢測SU11248對 K562細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)期細(xì)胞按5×103個細(xì)胞/孔接種至96孔培養(yǎng)板，體積100μl。實驗設(shè)藥物組(SU組)、二甲亞砜組(排除藥物溶劑毒性)及空白對照組，每組5個復(fù)孔。SU組分別與終濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 μg/ml 的 SU11248 共培養(yǎng)［1］。于培養(yǎng) 24、48、72、96 小時后，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。酶標(biāo)儀測每孔450 nm和630 nm雙波長下吸光度OD值。實驗重復(fù)3次，以O(shè)D值為縱軸，藥物作用時間為橫軸繪制細(xì)胞生長曲線。取48小時OD值計算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-藥物組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.2.2 細(xì)胞周期分析 分別收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，用70%乙醇 4℃固定過夜。加100μl RNase A 37℃水浴30分鐘，再加400μl PI染色混勻，4℃避光30分鐘，F(xiàn)CM檢測。結(jié)果用MultiCycle AV DNA Analysis軟件分析。

1.2.3 間接免疫熒光染色 收集各組細(xì)胞，加固定液固定30分鐘，洗滌后轉(zhuǎn)至載玻片，稍晾干，加封閉液封閉1小時。分別加入鼠抗人 p53單抗(1∶300)、p73 單抗(1∶250)、Cyto C 單抗(1∶50)及兔抗人NF-κB單抗(1∶300)，4℃孵育過夜。洗滌后加入羊抗鼠Cy3二抗和羊抗兔FITC二抗(均為1∶1 000)，避光孵育1小時。加DAPI染色液避光染色3～5分鐘，PBS洗滌后加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。實驗設(shè)兩組陰性對照:一組不加一抗和熒光標(biāo)記二抗，用于熒光強(qiáng)度的基線校正;一組僅加熒光二抗，用于非特異性結(jié)合對照。

1.2.4 免疫印跡實驗 提取各組細(xì)胞總蛋白，取50μg行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2小時，分別加入兔抗人單克隆一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶300)，兔抗人多克隆一抗 Caspase-9(1∶200)、Caspase-3(1∶150)，鼠抗人單克隆一抗 p53(1∶300)、p73(1∶500)、Cyto C(1∶300)及 β-actin(1∶1 000)，4℃孵育過夜。洗膜，分別加 HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5 000)，繼續(xù)孵育2小時，加ECL發(fā)光液，X射線曝光顯影。β-actin為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)用SensiAnsys軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法觀察SU11248對K562細(xì)胞生長的影響 由表1可見，當(dāng)藥物濃度超過1.0μg/ml時，SU組細(xì)胞生長較空白對照組和二甲亞砜組明顯受抑制(P ＜0.05)。濃度為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0μg/ml的 SU11248作用48小時后，細(xì)胞增殖抑制率分別為 3.38%、10.78%、27.09%、61.14%、83.37%、85.67%。隨藥物濃度的增大和作用時間延長，細(xì)胞增殖抑制率也隨之增大，當(dāng)SU11248濃度超過4.0μg/ml時，增殖抑制率隨藥物濃度增大及時間延長變化不再明顯(P＞0.05)。該藥對K562細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50約為2.5μg/ml。

2.2 FCM分析SU11248對K562細(xì)胞周期的影響 由圖1可見，濃度分別為 2.5、4.0、8.0 μg/ml的SU11248作用48小時后，G0/G1期的細(xì)胞分別占48.3%、79.48%、93.31%，較對照組(40.01%)差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且S期細(xì)胞所占比例(36.54%、20.52%、3.74%)隨藥物濃度的升高而逐漸減少，較對照組(45.86%)差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。可見，SU11248組較對照組出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞阻滯。

2.3 間接免疫熒光染色觀察凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)定位 圖2間接免疫熒光染色顯示，2.5μg/ml SU11248作用48小時后，SU11248組細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，胞核碎裂增多，Cyto C在胞質(zhì)中呈彌散或組塊狀分布，而對照組Cyto C呈細(xì)顆粒狀局限分布(圖2箭頭所示)。SU11248組和對照組 p53和p73表達(dá)主要位于胞質(zhì)，均勻彌散分布，表達(dá)差異不明顯。兩組NF-κB p65均主要定位于胞質(zhì)呈未激活狀態(tài)，均勻散在分布，表達(dá)差異亦不明顯。

2.4 免疫印跡檢測SU11248對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡結(jié)果顯示，SU11248組較對照組Bcl-2表達(dá)隨時間延長呈下降趨勢，Bax和Cyto C表達(dá)呈遞增趨勢，同時有Caspase-9和Caspase-3的剪接體增粗激活，而p73、p53及NF-κB p65蛋白的表達(dá)隨時間變化不明顯(圖3)，相應(yīng)灰度值分析見表2。

表1 不同濃度SU11248對K562細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effects of SU11248 with different dose on proliferation of K562 cells

圖1 不同濃度SU11248對K562細(xì)胞周期影響Fig.1 Effects of SU11248 with different dose on cell cycles by Flow cytometry

圖2 間接免疫熒光染色顯示SU11248作用48小時相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)定位(疊加圖)Fig.2 Effects of SU11248 on the expression and location of apoptosis related proteins by Indirect immunofluorescence(After overlayed)

表2 SU11248組及對照組中凋亡相關(guān)蛋白隨時間的表達(dá)變化Tab.2 The changes of apoptosis related proteins in SU11248 and control group along with time prolonged

圖3 SU11248對K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of SU11248 on the expression level of apoptosis related proteins in different time points by Western blot

3 討論

目前，除腎細(xì)胞癌和胃腸道間質(zhì)瘤外，SU11248在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、肝癌、甲狀腺癌及鼻咽癌等多種實體性腫瘤治療中均有報道，而在惡性血液病中的研究并不多見。國外有研究認(rèn)為該藥物可使急性髓性細(xì)胞白血病患者達(dá)到部分緩解［2］。本實驗研究表明，SU11248可明顯抑制慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞的增殖，說明該藥對非實體性腫瘤也有較強(qiáng)地抑制作用。

綜合文獻(xiàn)報道，SU11248主要通過阻斷VEGF和PDGF等信號通路(已被證實在促進(jìn)腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖中起重要作用)而抑制腫瘤的血管生成及細(xì)胞生長。SU11248是一種ATP競爭性蛋白激酶抑制劑，X射線晶體成像顯示，該藥能結(jié)合KIT酪氨酸激酶受體側(cè)鏈的DFG環(huán)［3］。在ATP位點(diǎn)結(jié)合區(qū)域，該藥通過其表面1～3個類似ATP中的氫鍵，緊密結(jié)合KIT酪氨酸激酶受體側(cè)鏈DFG環(huán)的苯丙氨酸殘基，占據(jù)ATP位點(diǎn)的腺嘌呤核苷區(qū)域，同ATP競爭結(jié)合受體中的ATP位點(diǎn)(為所有蛋白激酶共有)，阻止 VEGFR-2和 PDGFR-β等結(jié)合 ATP，阻斷VEGF和PDGF等信號通路，從而進(jìn)一步抑制Stat3(也可能通過激活I(lǐng)L-6R而抑制 Stat3)，下調(diào)Stat3調(diào)控血管生成因子基因p-Src、p-STAT3等的表達(dá)，最終降低腫瘤微血管密度［4-7］。此外，該藥可阻斷VEGFR1-3在腫瘤中的自分泌及旁分泌作用，增強(qiáng)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷毒性，并參與介導(dǎo)抗微血管、淋巴管生成及巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤血管內(nèi)滲作用［8，9］。然而 Dan 等［10］發(fā)現(xiàn)，采用 siRNA 敲除ccRCC細(xì)胞株(高表達(dá) PDGFR-β和 VEGFR-2)的PDGFR和/或 VEGFR基因亞型后并不能影響ccRCC細(xì)胞株的增殖，提示SU11248可能并不單獨(dú)依賴阻斷PDGF和VEGF信號途徑而抑制ccRCC細(xì)胞株的生長。

Fenton等［11］發(fā)現(xiàn)該藥能抑制腫瘤細(xì)胞中RET的自身磷酸化，同時阻斷胞質(zhì)中ERK1/2和JNK的磷酸化，激活信號傳感器，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖。本研究也發(fā)現(xiàn)SU11248可使慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞停滯于G0/G1期，隨藥物濃度的升高，G0/G1期細(xì)胞所占比例逐漸上升，同時S期細(xì)胞比例呈現(xiàn)下降趨勢?？梢奡U11248可以抑制K562細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程，使細(xì)胞停滯于G0/G1期而不能進(jìn)入S期，由于細(xì)胞不能進(jìn)入S期合成核酸等重要生命物質(zhì)，從而分裂增殖受到抑制。該過程具體機(jī)制可能與SU11248參與調(diào)節(jié)K562細(xì)胞周期蛋白表達(dá)有關(guān)，有待進(jìn)一步實驗證實。

慢性骨髓性白血病中多存在凋亡通路的調(diào)節(jié)紊亂，其中Bcl-2家族和Caspase家族起著重要作用。已證實細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax的比例對細(xì)胞凋亡起著重要調(diào)控作用。Bcl-2通過線粒體與Procaspase-9等形成復(fù)合物，抑制Cyto C的釋放等，而起到抗凋亡作用。Bax則通過其基因家族蛋白共有的同源結(jié)構(gòu)域與Bcl-2形成異源二聚體，同時促進(jìn)Cyto C的釋放，從而進(jìn)一步激活Procaspase-9、Procaspase-3等引起系列級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，SU11248可下調(diào)K562細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，同時能上調(diào)K562細(xì)胞中Bax的表達(dá)，并可引起凋亡通路的系列級聯(lián)反應(yīng)。免疫印跡顯示，SU11248組K562細(xì)胞胞質(zhì)Cyto C表達(dá)隨時間延長表達(dá)明顯增加，且免疫熒光染色可見SU11248組Cyto C在胞質(zhì)中呈散在粗塊狀分布，說明Cyto C已被激活而由線粒體釋放入胞質(zhì)。同時，SU11248組Procaspase-9 37kD剪接體表達(dá)增粗，說明Procaspase-9已被激活，同時檢測到Procaspase-3 17 kD的剪接體表達(dá)增粗，說明Procaspase-3也已激活。早期即有研究報道，p73和p53參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡過程，且二者之間亦存在相互作用，如p73可轉(zhuǎn)錄激活p53上游應(yīng)答基因等。Gong等［12］認(rèn)為p73可不依賴p53而被非受體酪氨酸激酶磷酸化激活，而進(jìn)一步發(fā)揮細(xì)胞周期抑制及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。NF-κB(主要為p65蛋白)也被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，正常條件下，NF-κB p65主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)，呈未激活狀態(tài)。當(dāng)其受到炎癥、病理損傷等因素刺激時，NF-κB p65就會由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核而呈激活狀態(tài)，從而進(jìn)一步發(fā)揮抑制腫瘤凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，SU11248對K562細(xì)胞中p73、p53及 NF-κB p65蛋白的表達(dá)及定位均沒有明顯影響，SU11248組和對照組p53和p73表達(dá)主要位于胞質(zhì)，且NF-κB p65均定位于胞質(zhì)呈未激活狀態(tài)。以上提示，SU11248可通過激活內(nèi)源性線粒體細(xì)胞途徑誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)SU11248可能并不僅僅依賴阻斷PDGF和VEGF信號通路而抑制細(xì)胞生長。在慢性骨髓性白血病中，SU11248可通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程及激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

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