盧圣樓等

摘要：通過(guò)微波輔助提取法與超聲提取法的比較研究與優(yōu)化，確定提取神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）種子中齊墩果酸的最佳工藝條件，采用ＨＰＬＣ法測(cè)定神秘果種子中齊墩果酸的含量。結(jié)果表明微波輔助提取法具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短和提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）；微波輔助提取法；超聲提取；高效液相色譜；齊墩果酸

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ６６７；Ｏ６５７．７文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0816-04

神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）為山欖科神秘屬常綠灌木植物，其果實(shí)中含有的神秘果素（Ｍｉｒａｃｕｌｉｎ）是一種變味蛋白，果肉在嘴中咀嚼后，再食酸味食物時(shí)其味道會(huì)轉(zhuǎn)甜［１］。２０世紀(jì)６０年代引入我國(guó)，在海南、云南、廣西等熱帶、亞熱帶地區(qū)小面積種植。神秘果可用作食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域的增甜劑、助食劑和食用色素等［２－７］。隨著對(duì)神秘果研究的不斷深入，其營(yíng)養(yǎng)保健作用也日益受到關(guān)注。

近年來(lái)，微波輔助提取法（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＭＡＥ）與超聲波提取法（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＵＥ）因具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單方便、無(wú)污染、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物提取方面得到了廣泛應(yīng)用［８－１２］。本試驗(yàn)分別采用微波輔助提取法、超聲波提取法從神秘果種子中提取齊墩果酸，根據(jù)齊墩果酸的提取率確定最佳提取方法，并采用ＨＰＬＣ法測(cè)定齊墩果酸的含量，旨在為今后神秘果的開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)方法。

１材料與方法

１．１材料

神秘果采集于海南省尖峰嶺國(guó)家森林保護(hù)區(qū)，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，神秘果種子經(jīng)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干后，粉碎至６０目備用。

羰基鐵粉（Ｃａｒｂｏｎｙｌ ｉｒｏｎ ｐｏｗｄｅｒ，ＣＩＰ）購(gòu)于陜西興化化學(xué)股份有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于四川維克奇生物科技有限公司；正己烷、無(wú)水乙醇、三氯甲烷和９５％乙醇（Ｖ／Ｖ）等均為分析純，甲醇為色譜純。

１．２儀器

ＷＲ－Ｃ微波樣品處理系統(tǒng)（北京盈安科技有限公司），ＲＥ－５２型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），高效液相色譜儀（日本島津公司），ＤＨＧ－９２４６Ａ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），ＴＣＬ－１６Ｇ型電動(dòng)離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)），ＵＶ－２４５０型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

１．３提取方法

１．３．１超聲提取法精確稱(chēng)取神秘果種子粉５．０ ｇ于錐形瓶中，加入５０．０ ｍＬ正己烷溶解，并置于超聲波儀中提?。?ｈ，蒸餾回收正己烷，所得浸膏狀物質(zhì)先后用水和氯仿洗滌，合并洗滌液，棄水層，氯仿層再用水洗滌６次，棄水層，揮發(fā)氯仿，殘余物用甲醇溶解，并定容至１０ ｍＬ，待用。

１．３．２微波輔助提取法精確稱(chēng)取神秘果種子粉２．０ ｇ于燒杯中，用１ ｇ ＣＩＰ與之充分混合后轉(zhuǎn)入微波提取罐內(nèi)，并添加１５ ｍＬ正己烷，蓋上壓力蓋、密封、放入微波樣品處理系統(tǒng)中升溫，于１２０ ℃下保持１２ ｍｉｎ后，將提取液全部轉(zhuǎn)移并用少量正己烷清洗內(nèi)罐，合并清洗液和提取液，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ后，揮干上層清液，用甲醇溶解殘余物，定容至１０ ｍＬ，待用。

１．4色譜條件

色譜柱為ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒ２ＳＩＬ Ｃ１８（４．０ ｍｍ × ２００ ｍｍ × ５ μｍ），流動(dòng)相（甲醇∶水＝９０∶１０，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為２１５ ｎｍ，柱溫為２５ ℃，流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．5齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

精確稱(chēng)取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品３．００ ｍｇ，定容至１０ ｍＬ，并逐級(jí)稀釋得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照上述色譜條件，進(jìn)樣２０ μＬ，以峰面積定量。以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ｍｇ／ｍＬ）為橫坐標(biāo)，峰面積（ｍＶ*ｓ）為縱坐標(biāo)繪制工作曲線(xiàn)，得回歸方程ｙ＝１ ７７１．６７ｘ＋１２ ８０９ ６００，相關(guān)系數(shù)０．９９９ ８，ＳＤ＝１８６．５６０ ４，Ｐ＜０．０００ １。結(jié)果表明齊墩果酸在０．０１～０．０５ ｍｇ／ｍＬ范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

２結(jié)果與分析

２．１微波輔助提取法與超聲提取法的比較

采用微波輔助提取法與超聲提取法對(duì)神秘果種子中齊墩果酸的提取效果進(jìn)行比較，其ＨＰＬＣ譜圖見(jiàn)圖１、圖２。由峰面積計(jì)算不同方法提取的齊墩果酸含量，結(jié)果如表１所示。

從圖１、圖２及表１可以看出，微波輔助提取神秘果種子中齊墩果酸的效果較好，故后續(xù)研究主要分析了微波輔助提取神秘果種子中齊墩果酸的提取條件。

２．２微波輔助提取法單因素試驗(yàn)

２．２．１提取溶劑對(duì)提取率的影響分別以正己烷、９５％乙醇（Ｖ／Ｖ）及兩者的混合溶液（１∶１，Ｖ／Ｖ）為提取劑進(jìn)行微波輔助提取實(shí)驗(yàn)，研究不同溶劑對(duì)神秘果種子中齊墩果酸提取率的影響。

采用上述色譜條件測(cè)得提取不同溶劑獲得的齊墩果酸含量，結(jié)果見(jiàn)表２。由表２可知，正己烷的提取率最高，其次是二者的混合溶液，乙醇的提取效率最低。這表明齊墩果酸在非極性溶劑中有較好的溶解性，故本研究選擇正己烷作為提取溶劑。

２．２．２提取時(shí)間對(duì)提取率的影響精確稱(chēng)取２ ｇ神秘果種子粉，加入２０ ｍＬ正己烷，按８、１０、１２、１４、１６ ｍｉｎ等５個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行微波輔助提取實(shí)驗(yàn)，考察不同提取時(shí)間對(duì)齊墩果酸提取效率的影響。

結(jié)果表明，提取時(shí)間短，則提取率低，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸增加，但到１２ ｍｉｎ后，增加趨于平緩。另一方面，提取時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)造成雜質(zhì)的干擾，所以最終確定１２ ｍｉｎ為最佳提取時(shí)間。

２．２．３提取溫度對(duì)提取率的影響精確稱(chēng)?。?ｇ神秘果種子粉，加入２０ ｍＬ正己烷，分別采用５個(gè)不同提取溫度（１００、１１０、１２０、１３０、１４０ ℃）進(jìn)行微波輔助提取試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖３。從圖３可知，提取率隨溫度升高而增大，至１２０ ℃達(dá)到最大值，其后提取率緩慢降低。這可能是隨著溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，浸出速度也隨之加快，但過(guò)高溫度可能會(huì)破壞齊墩果酸結(jié)構(gòu)，也可能是溫度過(guò)高引起乙醇的揮發(fā)，造成溶劑損失。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇１２０℃為最佳提取溫度。

２．３精密度試驗(yàn)

按１．３．２方法前處理，連續(xù)進(jìn)樣５次，每次進(jìn)樣２０ μＬ，記錄峰面積。結(jié)果如表３所示。由表可知，其ＲＳＤ＝０．６２６ ３％，表明本方法的精密度較好。

２．４重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批次樣品５份，按１．３．２方法進(jìn)行前處理，和色譜分析，結(jié)果如表４所示。由表4可知，其ＲＳＤ＝０．６２６ ５％，表明本法重現(xiàn)性較好。

２．５ＨＰＬＣ分析

采用ＨＰＬＣ測(cè)定不同溶劑提取神秘果種子中的齊墩果酸，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量，保留時(shí)間進(jìn)行定性，其色譜圖見(jiàn)圖４～７。

３小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)神秘果種子中齊墩果酸的提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度等方面的考察，確定了微波輔助提取的最佳條件為：以正己烷為溶劑，液料比１∶１０，在１２０ ℃下，經(jīng)過(guò)１２ ｍｉｎ提取。本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用該方法的提取率高，提取時(shí)間短，為今后神秘果的工業(yè)化開(kāi)發(fā)及深入研究提供了技術(shù)參考。