孔 凌 劉 超 喻 麟 包清彬

（1.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川 成都 611130；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

奶香飼料調(diào)味劑是飼料香味劑應(yīng)用最廣的香精之一，可以顯著改善飼料的適口性，提高動(dòng)物采食。目前飼料中常用的奶香飼料調(diào)味劑，多以香蘭素、乙基香蘭素、內(nèi)酯等合成原料進(jìn)行調(diào)配，往往具有一定的刺激性，缺乏天然感、留香時(shí)間差、耐高溫性差等缺點(diǎn)。近年來，國內(nèi)利用酶解技術(shù)制備奶油增香物在食品行業(yè)中應(yīng)用的已十分廣泛。武彥文等利用脂肪酶水解奶油、奶酪和牛奶，并對其酶解條件進(jìn)行了初步探討。劉志東等研究脂肪酶篩選后，酶解黃油制備了天然乳味增香物。天津諾奧科技發(fā)展公司的劉敏堯等以天然奶油為原料，采用含有脂肪酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和乳糖酶的復(fù)合酶制劑對其進(jìn)行水解可得到香氣逼真的奶味香精產(chǎn)物。汪建明等采用奶酪香精脂肪酶和復(fù)合蛋白酶共同作用水解牛奶得到具有濃郁奶酪風(fēng)味的添加劑，使人們能以牛奶的價(jià)格嘗到奶酪的風(fēng)味。通過大量實(shí)驗(yàn)證明，酶解制備的奶油增香物，具有天然的濃郁、圓潤、厚重、自然等特點(diǎn)，與合成香料匹配，能掩蓋化學(xué)香精刺激的感覺和產(chǎn)品中不愉悅的味道，使產(chǎn)品具有更佳的香味和口感。本文將利用酶解制備得到的奶油增香物，再經(jīng)過調(diào)香修飾形成新型奶香飼料調(diào)味劑，彌補(bǔ)了原有奶香飼料調(diào)味劑的不足，使奶香更加逼真，口感圓潤，香氣柔和并且增加了產(chǎn)品的留香能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光明無鹽奶油，光明乳業(yè)生產(chǎn)；

脂肪酶，丹麥諾維信公司生產(chǎn)；

乙醚、乙醇、氫氧化鈉，成都科龍?jiān)噭┥a(chǎn)；

電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；

KQ-100DE型數(shù)控超聲器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；

pHS-3C，成都方舟科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解奶油增香物工藝

奶油→加水→加單甘酯→超聲波溶解、乳化→巴氏殺菌→降溫→添加脂肪酶→水解→滅酶→離心分離→感官評定

1.2.2 添加酶解奶油增香物的奶香飼料調(diào)味劑

酶解奶油增香物＋奶香香基→混合→載體吸附→奶香飼料調(diào)味劑。

1.2.3 酶解奶油增香物考察指標(biāo)

由于香味的特殊性，目前世界上還無法完全用儀器和理化指標(biāo)對其進(jìn)行評分，所以還是以人的感官評分作為主要評分手段。本實(shí)驗(yàn)將采用行業(yè)通用的評定方法，以感官指標(biāo)作為酶解奶油增香物的主要評定指標(biāo)，同時(shí)測定其酸價(jià)，進(jìn)行輔助評定。

1.2.3.1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

參照GB/T14454.2—2008，采用評分法，見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3.2 酸價(jià)測定（參照GB/T5530—2005）

酸價(jià)是指中和1 g油脂中的游離脂肪酸所需氫氧化鉀的毫克數(shù)。

酸價(jià)計(jì)算公式：

式中：V——滴定消耗的氫氧化鉀溶液體積（ml）；

N——?dú)溲趸浫芤寒?dāng)量濃度；

56.1 ——?dú)溲趸浀暮量水?dāng)量；

W——試樣重量（g）。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和脂肪酶的相關(guān)特性，分別考察溫度、酶解時(shí)間、pH值、底物濃度、酶添加量對酶解效果的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)考察基礎(chǔ)上，以溫度、酶解時(shí)間、pH值、底物濃度、酶添加量為影響因素，用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解奶油增香物的制備（最佳工藝條件確定）

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 溫度的影響

脂肪酶對于溫度很敏感，溫度過高會(huì)使酶失活，溫度過低達(dá)不到酶的最適溫度，影響酶促反應(yīng)的效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，溫度對酶解效果的影響如圖1所示。

圖1 溫度對酶解反應(yīng)效果影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著溫度的增加，感官評分和酸價(jià)都在增加，但超過酶的最適溫度后，感官評分和酸價(jià)都降低。經(jīng)分析，酶解溫度超過50℃后，可能造成部分脂肪酶失活，酶解效率隨之下降，因此酶解后產(chǎn)物的感官評分下降。

2.1.1.2 酶解時(shí)間的影響

由于酶解反應(yīng)是很復(fù)雜的，反應(yīng)時(shí)間過短，脂肪酶對底物酶解不徹底，風(fēng)味物質(zhì)未完全生成；反應(yīng)時(shí)間過長，會(huì)使一些不良的風(fēng)味物質(zhì)被酶解出來，影響產(chǎn)物的整體風(fēng)味，時(shí)間過長也會(huì)造成成本的浪費(fèi)。要達(dá)到理想的效果必需控制好反應(yīng)時(shí)間。酶解時(shí)間對酶解反應(yīng)的影響如圖2所示。

圖2 酶解時(shí)間對酶解反應(yīng)效果影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著酶解時(shí)間的增加，感官評分和酸價(jià)都隨之增加，酶解時(shí)間越長，酸價(jià)越高，但酶解時(shí)間超過5 h后，感官評分反而下降。可能是由于酶解時(shí)間過長，部分底物被脂肪酶過度酶解為不良風(fēng)味物質(zhì)，影響了產(chǎn)物的整體風(fēng)味。

2.1.1.3 反應(yīng)體系pH值的影響

脂肪酶在進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí),只有在其最適pH值范圍內(nèi)方能表現(xiàn)出最佳活力，使酶促反應(yīng)得以更加順利進(jìn)行。反應(yīng)體系pH值對酶解反應(yīng)的影響如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著反應(yīng)體系pH值增加，感官評分和酸價(jià)都隨之增加，但當(dāng)pH值超過7后，感官評分與酸價(jià)則有所降低，這可能是由于pH值超過該脂肪酶的最適pH值，影響了脂肪酶活力，以致于酸價(jià)有所下降，可見該脂肪酶的最適pH值在7左右。

2.1.1.4 底物濃度的影響

酶解反應(yīng)，底物濃度較低時(shí)，酶解速度隨底物濃度的增加而增加；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭群?，酶解速度變緩直至不再增加。底物濃度對酶解反?yīng)的影響如圖4所示。

圖3 pH值對酶解反應(yīng)效果影響

圖4 底物濃度對酶解反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著底物濃度的增加，感官評分和酸價(jià)也在增加，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^50%時(shí)，感官評分和酸價(jià)都在下降，這可能是底物濃度過高，減緩了酶解反應(yīng)的速度。

2.1.1.5 酶添加量的影響

脂肪酶的添加要適量，脂肪酶用量太少，酶解不充分，風(fēng)味物質(zhì)生成少，奶香味將不足；酶用量過多，酶解反應(yīng)過于劇烈，會(huì)生成諸多不良風(fēng)味物質(zhì)，也會(huì)增加生產(chǎn)成本。酶添加量對酶解反應(yīng)的影響見圖5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著酶量的增加，酸價(jià)和感官評分也增加，但超過2%后，雖然酸價(jià)仍繼續(xù)增加，但是感官評分卻有所降低，這可能是由于酶添加量越多，酶解反應(yīng)越劇烈，所以酸價(jià)增加，但劇烈的酶促反應(yīng)也伴隨著不良風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，影響了感官評分。

圖5 酶添加量對酶解反應(yīng)效果影響

由以上單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸價(jià)越高，脂肪酶的酶解效率越高。但奶油酶解過度，會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)影響最終產(chǎn)物的整體風(fēng)味，造成感官評分降低。所以在酶解過程中，需要合理調(diào)控各影響因素，適當(dāng)控制酶解的程度，以求獲得最佳反應(yīng)產(chǎn)物。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置溫度、酶解時(shí)間、pH值、底物濃度、酶添加量5因素4水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，選用L16（45）正交表，實(shí)驗(yàn)因素水平見表3。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 正交因素水平

結(jié)果表明,最佳的工藝組合是A4B4C2D2E1，即當(dāng)溫度為55℃,酶解時(shí)間為7 h,pH值為6.5,底物濃度為40%,酶添加量 1%。比較各因素 R 值可知，RA＞RE＞RB＞RD＞RC,各因素對實(shí)驗(yàn)影響主次順序是：溫度＞酶添加量＞酶解時(shí)間＞底物濃度＞pH值,即溫度對酶解反應(yīng)的影響最大。在此優(yōu)化條件下制備的奶油增香物的奶香效果好。

表4 正交測定結(jié)果

2.1.3 利用酶解奶油增香物制備奶香飼料調(diào)味劑

通過正交優(yōu)化組合制備的酶解奶油增香物，加入香蘭素、乙基香蘭素、丁位十一內(nèi)酯、丁位十二內(nèi)酯、乙偶姻、丙位癸內(nèi)酯、丙位辛內(nèi)酯、丙位已內(nèi)酯等配制的奶香香基，通過吸附工藝而成奶香飼料調(diào)味劑，與相比未加入奶油酶解增香物的奶香飼料調(diào)味劑，通過評香專家進(jìn)行評比，結(jié)果見表5，當(dāng)隨著酶解奶油增香物的添加，其奶香更逼真，更具有天然感，香氣柔和，改善了產(chǎn)品的留香能力，口感更圓潤，考慮到成本問題，添加量控制在20%～25%。

3 結(jié)論

通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，得到了脂肪酶酶解奶油增香物的最優(yōu)工藝條件：即溫度為55℃，酶解時(shí)間為7 h，pH值為6.5，底物濃度為40%，酶添加量1%。

此優(yōu)化工藝條件下制備的奶油增香物，按照一定比例（20%～25%）加入各種香原料調(diào)配而成的奶香香基中，通過吸附工藝制備成奶香飼料調(diào)味劑，奶香更加逼真，口感圓潤，香氣柔和并且增加了產(chǎn)品的留香能力，適用于大規(guī)模的推廣。

表5 添加不同酶解奶油增香物比較結(jié)果

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