曹小妹 薛江超 高文惠 閆路娜

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018)

飼料中加入防霉劑及防腐劑可以起到防腐、抑菌、殺菌、延長保質期等作用。防腐劑的種類繁多，常見報道的有山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類。飼料中加入防腐劑有其必要性但是用量要合乎相關規(guī)定，因此探索飼料中防腐劑高效快速的檢測方法尤為重要。目前毛細管電泳法檢測防腐劑的報道多為堿性條件下的分離測定[1-7]，堿性不利于柱子的使用壽命；而采用酸性緩沖溶液在低pH值下，吸附和電滲流值都很小，毛細管涂層的壽命較長[8]。Mahuzier等[9]利用膠束電動色譜分別在pH值9.5和pH值2.1條件下測定MP、EP、BP、PP和對羥基苯甲酸，但是pH值9.5時對羥基苯甲酸的峰形很差。He等[10]曾報道了在pH值2.28分離測定了MP、EP、BP、PP，取得滿意的分離效果。本試驗旨在探索酸性條件下多種防腐劑的分離檢測方法。分別從緩沖液的種類，緩沖液的濃度以及pH值幾個方面選擇合適的分離條件，最終獲得七種物質的高效分離。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)。

標準品：山梨酸（SA）、苯甲酸（BA）、脫氫乙酸(DHA)、對羥基苯甲酸甲酯(MP)、對羥基苯甲酸乙酯(EP)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)、對羥基苯甲酸丁酯(BP)純度均大于99%(Sigma)。

標準溶液的配制：分別準確稱取SA、BA、DHA、MP、EP、PP、BP標品 50 mg用甲醇溶解，分別定容至100 ml容量瓶。

1.2 儀器

CAPEL-105高效毛細管電泳儀，配有紫外-可見檢測器(俄羅斯劉梅克斯公司生產)；LD5-2A低速離心機(北京雷勃爾離心機有限公司生產)；KH5200型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司生產)；756P紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司生產）；FA2204N分析天平(上海菁海儀器有限公司生產)。

1.3 樣品處理

飼料樣品用甲醇：水=1：1（體積比）的混合液提取,超聲25 min,然后在3000 r/min轉速下離心5 min,取上清液過0.45 μm微孔濾膜后直接上機測定。

1.4 緩沖溶液的配制

用超純水分別配制40 mmol/l KH2PO4和100 mmol/l SDS溶液，將兩種溶液以體積比為1：1進行混合作為緩沖液，并調節(jié)pH值至4.00，過0.45 μm微孔濾膜備用。

1.5 色譜條件

彈性石英毛細管柱（50 cm×75 μm），檢測波長為245 nm，分析電壓為-18 kV，進樣時間為5 s，檢測溫度為25℃。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

七種防腐劑的紫外光譜掃描圖如圖1所示。SA、BA、DHA 的最大吸收波長分別為 256、226、226 nm，MP、EP、PP、BP的最大吸收波長均為258 nm。若選定256 nm，SA、MP、EP、PP、BP 可以獲得較高的靈敏度，但是BA和DHA在此處幾乎沒有吸收，故256 nm不可取。綜合考慮七種物質的吸收情況并且獲得相對較好的靈敏度，本試驗選擇245 nm作為檢測波長。

圖1 七種防腐劑的紫外吸收曲線

2.2 緩沖液的選擇

本試驗探究酸性條件下七種物質的分離情況，因此選擇酸性的KH2PO4溶液。對羥基苯甲酸酯類是中性物質，需添加表面活性劑SDS而形成膠束電泳。

對于緩沖液濃度的選擇，分別配制了40 mmol/l KH2PO4(A)和100 mmol/l SDS(B)以不同體積比的混合液，如 1：1，1：2，1：3，1：4，2：1，3：1，4：1。試驗結果是：配制的A和B兩種溶液體積比為1：4，1：3時，PP和BP不能完全分離(見圖2中a和b)，1：2時PP和BP，MP和BA不能完全分離（見圖2中c）；體積比為 2：1，3：1，4：1 時，即當緩沖液中 KH2PO4的濃度接近或大于SDS的濃度時，溶液有析出現象，不能正常使用。而當體積比為1：1，七種防腐劑可實現完全分離，故確定體積比為1：1。

圖2 在KH2PO4和SDS不同體積比下七種防腐劑的色譜

pH值能影響膠束電動色譜中帶電組分遷移的速度，但是不改變SDS的荷電狀況，因此不影響它的泳流速度。因電滲流受pH值的限制，故它的凈速度也與pH值有關[8]。在酸性條件下，分別考察了pH值為2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 六個條件下七種物質的分離情況。通過色譜圖分析得到：不同的pH值影響到物質的出峰順序，在pH=2.50～3.50條件下，MP在BA之前出峰，而在pH=4.00～5.00時BA在MP之前出峰；且從pH=2.50到pH=4.50，隨著pH值的增加七種物質的出峰時間延長，但是pH=2.50～3.50時BP和PP分離不好，且pH=3.50時MP和BA也分離不好。綜合考慮分離效果和出峰時間，確定4.00為試驗最佳pH值。

綜上所述：在最佳條件下七種物質的標準品混合溶液分離色譜圖如圖3所示。由圖3中看出，七種防腐劑在19 min內實現了基線分離。

圖3 七種防腐劑標準品的分離色譜

2.3 線性范圍與檢測限

配制一系列濃度（0.5～500 μg/ml）的七種防腐劑的標準溶液，在選定的最佳色譜條件下進行線性關系和檢測限的測定。由表1結果可以看出，SA、BA的線性范圍分別為 1～500，3～500 μg/ml，DHA、MP、PP、BP 和 PP 的線性范圍均為 5～500 μg/ml。SA、BA、DHA和四種對羥基苯甲酸酯類的檢測限分別為0.5、1.5、3、2.5 μg/ml。

表1 七種防腐劑的線性關系及檢測限

2.4 樣品的檢測

飼料樣品按照1.3節(jié)處理。典型飼料樣品測定結果見圖4和圖5。由圖4、圖5看出,牛飼料樣品中檢測到BA，預混料中檢測到EP和BA。

圖4 牛飼料的樣品

圖5 預混料的樣品

2.5 回收率試驗

對飼料樣品進行低水平和高水平的加標回收率試驗，測定結果見表2。七種防腐劑的回收率為80.8%～107.0%，相對標準偏差≤5.0%。

表2 七種防腐劑的加標回收率和精密度(n=5)

3 結論

本試驗建立了一種在酸性條件下同時檢測飼料中酸類和酯類等七種防腐劑的快速、高效毛細管電泳方法，在19 min內實現了七種防腐劑的分離。七種防腐劑的檢測限在 0.5～3 μg/ml，回收率為 80.8%～107.0%，相對標準偏差≤5.0%。本方法可以作為飼料企業(yè)自檢和其他機構檢測的參考方法。

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