董夏蓮，王紅英，錢斯日古楞，李長清

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034)

紅曲霉(Monascns)是一種小型絲狀腐生真菌，屬真菌門，子囊菌綱，真子囊菌亞綱，曲霉科，紅曲屬［1］，廣泛存在于新鮮的牧草、泥土、橡膠及松樹根等組織中［2］。它嗜酸，特別是乳酸，耐高溫、耐乙醇，生長最適pH為3.5～5.5，生長溫度為26～42℃。它多出現(xiàn)在乳酸自然發(fā)酵基物中，能利用多種碳源、氮源。紅曲霉在其生長過程中產(chǎn)生紅曲色素，純天然，無毒無副作用。近年來，由于合成色素的安全性受到挑戰(zhàn)，天然色素日益受到重視［3-4］。紅曲霉在許多亞洲國家特別是東南亞被用來作為加工傳統(tǒng)食品的微生物。在我國的利用也有悠久的歷史，被廣泛運(yùn)用于釀酒、腐乳、食醋、食品色素、中藥等方面［5］。

紅曲色素不僅可作為天然色素，而且具有明顯的脂肪酶抑制活性。因此，在降血脂保健品和減肥產(chǎn)品的研發(fā)中具有廣泛應(yīng)用前景［6-8］。人們苦于肥胖引起的疾病，如果能夠阻止脂肪的消化吸收，對高脂肪引起的肥胖和疾病將有很大的改善。目前市場上常見的減肥藥物主要是作用于大腦，通過抑制食欲減少食品的攝入量，也有一部分是通過抑制脂肪酶活性，以減少脂肪吸收而達(dá)到減肥目的。但是，這些皆是合成類藥物，有不同程度的副作用。因此越來越多的學(xué)者將目光瞄準(zhǔn)了天然藥物［9］。

本實(shí)驗(yàn)以D-青霉胺(H-Pen)為誘導(dǎo)劑，使紅曲霉誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的紅曲色素，并對紅曲色素進(jìn)行分離提取，同時對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。這將對紅曲色素減肥天然保健品的研發(fā)探索一條新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料紅曲霉Monascus購于大連旅順圓寶豆制品廠;D-青霉胺(H-Pen)，上海晶純試劑有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基硝酸鈉1 g，葡萄糖2.5 g，磷酸二氫鉀0.075 g，硫酸鎂0.05 g，用50 mL蒸餾水溶解，用乳酸調(diào)節(jié)其pH為3.5，121℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉的培養(yǎng)將紅曲霉孢子接入裝有玻璃珠的三角瓶中，30℃振蕩1 h，使孢子充分打散，取1 mL孢子懸液梯度稀釋至1×107個/mL備用。

在無菌操作條件下，向盛有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d取出。

1.3.2 誘導(dǎo)產(chǎn)生紅曲色素將0.35 g H-Pen加入50 mL蒸餾水中充分溶解混勻，制備成0.7%的誘導(dǎo)劑溶液。

培養(yǎng)基滅菌后，在無菌條件下，向培養(yǎng)基中接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，其中一瓶培養(yǎng)基加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%誘導(dǎo)劑，另外一瓶不加誘導(dǎo)劑做空白對照，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d取出。

將培養(yǎng)得到的發(fā)酵液用四層紗布過濾，洗滌兩遍，擠干，再用濾紙反復(fù)壓干稱定質(zhì)量，即為濕菌體生物量。

發(fā)酵液過濾后得到的菌體加入15 mL無水乙醇37℃條件下萃取0.5 h，離心取上清液，用適量無水乙醇稀釋，用分光光度計在410 nm處測定紅曲色素提取液的OD值［10］。用無水乙醇做空白對照。

1.3.2.1 誘導(dǎo)劑添加量對紅曲色素產(chǎn)生的影響在無菌條件下，對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的誘導(dǎo)劑進(jìn)行梯度稀釋，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、0.07%、0.007%、0.000 7%、0.000 07%的誘導(dǎo)劑溶液。取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的誘導(dǎo)劑各1 mL，分別加到培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基中接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。無誘導(dǎo)劑的做空白參照。

1.3.2.2 pH值對誘導(dǎo)產(chǎn)生紅曲色素的影響用乳酸為調(diào)節(jié)劑，分別配置pH為2.8、3.8、4.8、5.8、6.8的培養(yǎng)基。滅菌后，在無菌條件下各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.000 7%的誘導(dǎo)劑，接入1 mL 107個/mL的紅曲霉孢子菌懸液。在30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價

1.3.2.3 培養(yǎng)溫度對誘導(dǎo)產(chǎn)生紅曲色素的影響配制培養(yǎng)基，用乳酸調(diào)節(jié)pH到3.5，在無菌條件下，向培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.000 7%的誘導(dǎo)劑，接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，培養(yǎng)溫度分別為26、28、30、32、35℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。

1.3.2.4 培養(yǎng)時間對誘導(dǎo)產(chǎn)生紅曲色素的影響配制培養(yǎng)基，用乳酸調(diào)節(jié)pH到3.5，在無菌條件下，所有培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.000 7%的誘導(dǎo)劑，接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，培養(yǎng)溫度為30℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)8、10、12、14、16d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。

1.3.2.5 裝瓶量對誘導(dǎo)產(chǎn)生紅曲色素的影響配制培養(yǎng)基，用乳酸調(diào)節(jié)pH到3.5，分別取50、100、150 mL培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，在無菌條件下，所有培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.000 7%的誘導(dǎo)劑，接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d。取出，測定紅曲霉的濕菌體量和紅曲色素的色價。

2 結(jié)果

2.1 添加誘導(dǎo)劑對紅曲色素產(chǎn)生的影響配制兩瓶培養(yǎng)基，一瓶加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的誘導(dǎo)劑，另外一瓶不加誘導(dǎo)劑做空白參照，兩瓶培養(yǎng)基中均接入1 mL 107個/mL紅曲霉孢子菌懸液，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d，結(jié)果見圖1。

圖1 誘導(dǎo)劑對菌體生長的影響Fig.1 Inducer effects on cell growth

由圖可見，通過對有誘導(dǎo)劑與無誘導(dǎo)劑的紅曲霉的菌質(zhì)量及胞內(nèi)紅色素的吸光值的對比，誘導(dǎo)劑促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素，同時對菌體生長有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 誘導(dǎo)產(chǎn)生紅曲色素

2.2.1 誘導(dǎo)劑添加量對紅曲色素產(chǎn)生的影響分別向培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7～0.000 07%的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)后，得到菌體質(zhì)量及胞內(nèi)色素的色價。沒添加誘導(dǎo)劑的做空白對照，結(jié)果見圖2。

圖2 誘導(dǎo)劑添加量的選擇Fig.2 Choice of the amount of inducer added

由圖可見，誘導(dǎo)劑添加量為0.000 7%誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅曲色素色價最高，菌體質(zhì)量相對較大。綜合考慮菌體的色價、菌體生長量，確定誘導(dǎo)劑加量為0.000 7%是最佳誘導(dǎo)劑加量。

2.2.2 誘導(dǎo)pH值的確定用乳酸為調(diào)節(jié)劑，配制pH為2.8～6.8的培養(yǎng)基。培養(yǎng)后，得到菌體質(zhì)量及胞內(nèi)色素的色價，結(jié)果見圖3。

圖3 最佳培養(yǎng)pH的確定Fig.3 Determination of optimal culture pH

由圖可見，pH值為3.8的時候，誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅曲霉菌量最大，紅曲色素色價最高。確定pH值3.8為最佳誘導(dǎo)pH。

2.2.3 誘導(dǎo)溫度的確定將紅曲霉分別在26～35℃條件下震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)后，得到菌體重量及胞內(nèi)色素的色價，結(jié)果見圖4。

圖4 最佳培養(yǎng)溫度的確定Fig.4 Determination of optimal culture temperature

由圖可見，培養(yǎng)溫度為26、28、30、32℃時，紅曲霉的菌體量、色價依次明顯遞增，32℃到35℃紅曲霉的菌體量、色價沒有明顯變化。綜合考慮菌體的色價、菌體生長量及最低耗能，確定32℃為誘導(dǎo)紅曲霉產(chǎn)生紅色素的最佳溫度。

2.2.4 培養(yǎng)時間的確定其它培養(yǎng)條件不變的情況下，將紅曲霉分別培養(yǎng)6～14 d，得到菌體質(zhì)量及胞內(nèi)色素的色價，結(jié)果見圖5。

由圖可見，培養(yǎng)時間為6、8、10、12 d，紅曲霉的菌體量、色價依次明顯遞增，12 d到14 d紅曲霉的菌體量、色價沒有明顯變化。綜合考慮菌體的色價、菌體生長量及最低耗能，確定12 d為誘導(dǎo)紅曲霉產(chǎn)生紅色素的最佳培養(yǎng)時間。

圖5 最佳培養(yǎng)時間的確定Fig.5 Determination of optimal culture time

2.2.5 裝液量的優(yōu)化為了考察通風(fēng)量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響，同時又考慮到最低的動力消耗而采用搖瓶不同裝液量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響［11］。結(jié)果見表1。

表1 不同裝液量對紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的影響Tab.1 Effects of different volumes in flask liquid on pigment of Monascus

3 討論

H-Pen誘導(dǎo)紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素效果明顯，其最佳條件為，誘導(dǎo)劑添加量為0.000 7%，培養(yǎng)pH條件為3.8，溫度為30℃，培養(yǎng)時間為12 d，最佳每瓶裝液量50 mL。

紅曲色素是目前唯一允許在食品中使用的天然真菌色素，紅曲色素作為食品添加劑時除了可提高食品的色澤還可抑制體內(nèi)脂肪酶的活力，達(dá)到降低脂肪吸收的效果，同時，通過抑制有毒物質(zhì)(桔霉素)的合成［12］，提高紅曲色素的產(chǎn)量，提高其色價，確定出誘導(dǎo)條件和對脂肪酶抑制力的關(guān)系，提高紅曲色素的穩(wěn)定性以后，其產(chǎn)品將會有更廣闊的前景。

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