王增仙

（山西生物應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物制藥工程系，山西 太原 030031）

黃酮是廣泛存在于植物中的多酚類化合物，槲皮素是黃酮醇類化合物的典型代表，它最顯著的特點是抗氧化性強，是植物界分布最廣的黃酮類化合物，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮。人們?nèi)粘ｏ嬍持械难笫[、蘋果、紅酒中就含有大量的黃酮醇類化合物［1］。已有的研究結(jié)果表明槲皮素具有抗氧化、抗癌防癌、抗炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能等活性，在防治慢性退行性疾病過程中發(fā)揮重要作用［2-4］。槲皮素等黃酮類化合物也是中藥及其復(fù)方中的主要活性成分之一，受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。實驗動物或人通過口服攝入槲皮素后，槲皮素在血漿中的物質(zhì)形式以及代謝產(chǎn)物的情況一直是研究的熱點。腸代謝［5］以及體內(nèi)生物利用度［6］研究表明槲皮素代謝中只有很少或者沒有槲皮素糖苷配基存在［7］，其代謝物主要是經(jīng)由小腸或者肝臟代謝以槲皮素葡萄糖醛酸，槲皮素硫酸鹽，氧-甲基化槲皮素以及氧-甲基化槲皮素葡萄糖醛酸的形式存在［8］。陳峰等采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，在大氣壓電噴霧離子源負離子條件下，測定了大鼠口服槲皮素單體后血漿中槲皮素和異鼠李素［9］。安代志等［10］采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析經(jīng)口給予槲皮素后大鼠門靜脈血槲皮素及其代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明槲皮素處理大鼠門靜脈血中可以檢測到一定質(zhì)量濃度的槲皮素以及異鼠李素、檉柳黃素、槲皮素硫酸酯、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸等。本實驗通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定人口服槲皮素后血漿中的槲皮素及其代謝產(chǎn)物，為研究含槲皮素等黃酮類成分中藥及其復(fù)方藥動學(xué)研究以及血樣濃度檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (ACQUITY UPLC-Quattro Premier XE，美國 Waters公司)。Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)。乙腈(Sigma-Aldrich公司，色譜純)，甲醇(Sigma-aldrich公司，色譜純)，甲酸(Sigma-Aldrich公司，色譜純)，水為Milli-Q超純水。

槲皮素(批號:Q4951)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸(批號:90733)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷(批號:16654)，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸(自制，經(jīng) MS和NMR鑒定)，芹菜素(批號:42251)，抗壞血酸(批號:A5960)購于Sigma-aldrich公司。

1.2 對照品溶液的制備 取槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品適量，精密稱定，溶于甲醇，制備成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的貯備液。取抗壞血酸適量，精密稱定，加入甲醇制備成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。所得貯備溶液均置于4℃冰箱避光保存。

1.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜測定條件 色譜條件:Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；流動相 A 為1%甲酸水溶液、B為1%甲酸乙腈溶液梯度洗脫，0 min，B為5%；10 min，B為 38%；10～12 min，B為 38%；12～14 min，B為100%；14～14.5 min，B為100% ～5%；14.5～15.5 min，B為5%；體積流量0.40 mL/min；柱溫40°C；進樣5 μL。質(zhì)譜條件:儀器為Waters公司Quattro Premier XE串聯(lián)質(zhì)譜儀。電噴霧離子源(ESI)，采用負離子模式檢測；脫溶劑氣流量為600 L/h，脫溶劑氣溫度為350℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度為120℃，毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為35 V；選擇離子監(jiān)測模式，檢測離子質(zhì)荷比為301.1(槲皮素)，477.1(槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸)，463.2(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)，491.2(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸)，269.1(芹菜素)，裂解電壓分別為40 V，30 V，40 V，25 V，50 V。

1.4 生物樣品制備 血漿樣品的處理根據(jù)文獻［11］進行微小變動后操作。100 μL血漿樣品用10 μL 20% 甲酸溶液酸化，加入10 μL抗壞血酸 (10 mg/mL)防止樣品處理過程中黃酮類成分的氧化。300 μL乙腈(含400 ng/mL內(nèi)標物芹菜素)加入到血漿樣品中用于沉蛋白以及提取黃酮類化合物。上述血漿樣品混懸10 min，超聲5 min，在4℃下13000 r/min離心20 min，收集上清液。殘渣繼續(xù)加入300 μL的甲醇按照上述步驟進行第二次提取。合并乙腈與甲醇提取液，真空濃縮至干，提取物用50 μL甲醇和100 μL 1%甲酸水溶液復(fù)溶，搖勻，過0.22 μm濾膜，進樣分析。

2 方法與結(jié)果

2.1 專屬性考察 分別取空白血漿、均勻混合的槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的混合對照品溶液以及加入內(nèi)標芹菜素的健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依1.4項方法操作，得圖1。由圖可以看出各物質(zhì)分離度較好，槲皮素的保留時間約為8.09 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的保留時間約為5.26 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留時間約為5.25 min，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的保留時間約為6.38 min，內(nèi)標芹菜素的保留時間為9.39 min。結(jié)果表明，采用選擇離子模式，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標物的測定。

圖1 UPLC-MS色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品貯備液，稀釋成0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 μg/mL的對照品溶液，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按上述條件測定槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的吸收峰峰面積，以進樣量為橫坐標(x)，以峰面積積分值為縱坐標(y)，進行回歸處理，上述物質(zhì)回歸方程分別為:y=2.43x+98.708，r=0.9970(槲皮素)；y=1.71x+22.083；r=0.9997(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)；y=1.191x+16.294，r=0.9996(槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸)；y=0.78x+18.861，r=0.9980(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸)。結(jié)果表明，槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品分別在5～1280 ng/mL范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 精密吸取槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品溶液各2 μL，重復(fù)進樣6次，測定槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸對照品的峰面積，槲皮素峰面積的RSD為1.67%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸峰面積的RSD為1.92%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD為2.33%，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸峰面積的RSD為2.15%。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液1份，分別于0、0.5、1、2、4、8、16 h 進樣測定，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸積分面積的RSD分別為3.68%，2.97%和4.52%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實驗 取同一供試品溶液約100 μL，平行制備6份，按樣品的測定方法進行測定，計算槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸質(zhì)量濃度，結(jié)果RSD分別為2.53%，3.16%和3.42% ，表明本方法重復(fù)性較好。

2.6 提取回收率 以槲皮素-3-O-葡萄糖苷為例，將槲皮素-3-O-葡萄糖苷標準液加入空白血漿中，分別配制5.0，20.0和80.0 μg/L 3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個質(zhì)量濃度5份，依1.4項方法操作，記錄槲皮素-3-O-葡萄糖苷的峰面積A血漿；另取高、中、低3個質(zhì)量濃度槲皮素-3-O-葡萄糖苷質(zhì)控液，經(jīng)流動相稀釋10倍后直接進樣分析，每個質(zhì)量濃度5份，記錄槲皮素-3-O-葡萄糖苷的峰面積A標品，則血漿中槲皮素-3-O-葡萄糖苷提取回收率(%)=A血漿/A標品×100%，相對回收率用實測質(zhì)量濃度平均值與標示質(zhì)量濃度的比值百分數(shù)(%)表示，結(jié)果見表1。結(jié)果表明日間、日內(nèi)精密度及相對回收率均滿足生物樣品分析的要求。代謝物槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸經(jīng)同樣方法測定，結(jié)果表明也滿足生物樣品分析的要求。

表1 血漿樣品中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的回收率與精密度(n=5)

2.7 樣品測定結(jié)果 健康男性志愿者(n=6)分別口服槲皮素 200 mg，志愿者分別在服藥前、服藥后 0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取前臂靜脈血4 mL，置肝素抗凝管內(nèi)、離心(4000 r/min，10 min)分離出血漿，置－80℃冷凍保存?zhèn)溆?。?.4項方法處理血漿樣品，本實驗測定了0.5，1 h采集血漿中物質(zhì)濃度來驗證本實驗方法的可行性。在各分析批次樣品中均勻隨機放置高、中、低3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，以此來監(jiān)控分析過程的有效性。定量測定結(jié)果見表2。

表2 樣品定量測定結(jié)果 (n=5)

3 討論

3.1 采用UPLC-MS/MS，能夠定性人口服槲皮素后血漿樣品中槲皮素及其幾種代謝產(chǎn)物，例如槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的保留時間約為5.26 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留時間約為5.25 min，但采用選擇離子模式，由于槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的檢測離子質(zhì)荷比為477.1，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的檢測離子質(zhì)荷比為463.2，因此可以準確定性。空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標物的測定。

3.2 槲皮素等黃酮類物質(zhì)很容易氧化，因此在處理過程中加入抗壞血酸防止樣品的氧化，同時樣品必須在盡可能短的時間內(nèi)測定。

3.3 通過對人口服槲皮素后血漿中代謝物的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中檢測不到槲皮素原形藥物，說明血漿中槲皮素以結(jié)合物的形式存在。現(xiàn)有文獻報道［12］槲皮素在體內(nèi)以槲皮素、異鼠李素、檉柳素與葡萄糖醛酸及硫酸形成結(jié)合物，通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定最終物質(zhì)形式。

3.4 在有關(guān)槲皮素等黃酮類成分的體內(nèi)藥物分析時樣品中常加入芹菜素(Apigenin)作為內(nèi)標物，用以校準和消除由于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準確度。

3.5 通過對人口服槲皮素單體后血漿中的代謝產(chǎn)物的研究，了解槲皮素的入血形式，為含有槲皮素成分的中藥材及其復(fù)方制劑的藥代動力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

［1］Crozier A，Lean M E J，McDonald M S，et al.Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes，onions，lettuce and celery［J］.J Agric Food Chem，1997，45(3):590-595.

［2］王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(2):171-173.

［3］秦曉蓉，張銘金，高緒娜，等.槲皮素抗菌活性的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26(4):55-57.

［4］Graf B A，Mullen W，Caldwell S T，et al.Disposition and metabolism of［2-14C］quercetin-4'-glucoside in rats［J］.Drug Metab Dispos，2005，33(7):1036-1043.

［5］Spencer J P，Chowrimootoo G，Choudhury R，et al.The small intestine can both absorb and glucuronidate luminal flavonoids［J］.FEBS Lett，1999，458(2):224-230.

［6］Scheline R R.CRC Handbook of mammalian metabolism of plant compounds［M］.Boca Ranton:CRC Press，1999:243-295.

［7］Scalbert A，Williamson G.Dietary intake and bioavailability of polyphenols［J］.J Nutr，2000，130(8S)，2073S-2085S.

［8］Morand C，Manach C，Crespy V，et al.Respective bioavailability of quercetin aglycone and its glycosides in a rat model［J］.Biofactors，2000，12(1-4)，169-174.

［9］陳 峰，任守忠，魏 娜，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大鼠血漿中的槲皮素代謝物［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43(3):225-227.

［10］安代志，吳勝明，韋京豫，等.大鼠灌胃槲皮素后門靜脈槲皮素及其代謝產(chǎn)物的液質(zhì)分析［J］.衛(wèi)生研究，2009，38(4):417-419.

［11］Day A J，Mellon F，Barron D，et al.Human metabolism of diet-ary flavonoids:identification of plasma metabolites of quercetin［J］.Free Rad Res，2001，35(6):941-952.

［12］Claudine M，Gary W，Christine M，et al.Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans(I)Review of 97 bioavailability studies ［J］.Am J Clin Nutr，2005，81(1S):230S-242S.