張 韻， 傅 穎， 吳霞紅

（1.上海市中藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)室，上海 200336；2.上海體育科學(xué)研究所，上海 200030）

五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果實(shí)，其功效收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心［1］，兼有藥用與營養(yǎng)作用兩種屬性。近年來，對(duì)五味子的研究表明，其具有增強(qiáng)免疫、提高抗氧化機(jī)能以及改善腸道菌群等作用［2-3］。五味子中有機(jī)酸含有量的高低代表著藥材的成熟度，與五味子的有機(jī)酸如蘋果酸、檸檬酸具有一定的關(guān)聯(lián)，本實(shí)驗(yàn)以研究有機(jī)酸為目的，開發(fā)新產(chǎn)品，為保證產(chǎn)品質(zhì)量，把好原藥材質(zhì)量關(guān)，有必要建立五味子中蘋果酸、檸檬酸的高效液相檢測(cè)方法。

1 儀器、試藥與樣品

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀；G1322A自動(dòng)進(jìn)樣器；G1316A柱溫箱；DAD G1315B檢測(cè)器；超聲波清洗機(jī)SK7200LH，功率350 W，59 kHZ，上?？茖?dǎo)超聲儀有限公司。

1.2 試藥、試劑 檸檬酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111679-200401，供定量測(cè)定用)；L-蘋果酸對(duì)照品SIGMA公司，批號(hào) 01011AE，供定量測(cè)定用)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。五味子藥材產(chǎn)自遼寧，6個(gè)批次(批號(hào)見樣品檢驗(yàn)結(jié)果)均按照2010版中國人民共和國藥典一部檢驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。

2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按2010年版中國藥典一部梯度洗脫方法(按表1進(jìn)行梯度洗脫)，檢測(cè)波長(zhǎng)為209 nm；柱溫15℃；進(jìn)樣量10 μL；色譜柱理論塔板數(shù)按蘋果酸、檸檬酸色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

表1 蘋果酸、檸檬酸梯度洗脫順序

3 方法與結(jié)果

3.1 對(duì)照品溶液的制備

蘋果酸對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘋果酸對(duì)照品11.62 mg，置25 mL量瓶中，加0.1%磷酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成0.4648 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

檸檬酸對(duì)照品溶液的制備 精密稱取檸檬酸對(duì)照品21.22 mg置25 mL量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.849 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

3.2 供試品溶液的制備 取五味子藥材適量粉碎，使其全部通過60目篩。精密稱取粉末約0.5 g置25 mL量瓶中，加水適量超聲60 min，冷卻至室溫，定容，濾過，取濾液15 mL，減壓濃縮至干，用0.1%H3PO4溶液溶解并定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

3.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B；檢測(cè)波長(zhǎng)為209 nm；蘋果酸、檸檬酸的測(cè)定均按表1進(jìn)行梯度洗脫，蘋果酸測(cè)定的柱溫為15℃；檸檬酸測(cè)定的柱溫為23℃；以蘋果酸、檸檬酸色譜峰計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

3.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取蘋果酸和檸檬酸對(duì)照品的水溶液，高效液相色譜儀分別進(jìn)樣，考察蘋果酸和檸檬酸在190～380 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜吸收?qǐng)D，蘋果酸和檸檬酸在209 nm處有穩(wěn)定的、較大的吸收峰，故選擇209 nm作為蘋果酸和檸檬酸HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3.2 供試品提取方法的選擇

取0.5061 g藥材粉末，置25 mL量瓶中，加水適量超聲1 h，冷卻至室溫并稀釋至刻度，取濾液15 mL，按3.2項(xiàng)供試品制備項(xiàng)制備，在上述蘋果酸和檸檬酸色譜條件下，分別注樣分析。結(jié)果見表2。

取0.5216 g藥材粉末，精密加入25 mL水，回流1 h，冷卻至室溫并稀釋至刻度，取濾液15 mL，按供試品制備項(xiàng)制備，在上述蘋果酸和檸檬酸色譜條件下色譜條件下，分別注樣分析。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，采用超聲提取法提取比較完全，且方法操作簡(jiǎn)單。

表2 藥材中蘋果酸和檸檬酸測(cè)定的提取方法比較

3.3.3 蘋果酸和檸檬酸線性關(guān)系考察 分別吸取蘋果酸和檸檬酸對(duì)照品備用液，在上述蘋果酸和檸檬酸色譜條件下，蘋果酸進(jìn)樣 1、3、5、8、10、15、20 μL，檸檬酸進(jìn)樣 2、5、8、10、12、15、18 μL，各濃度進(jìn)樣 2 次，取峰面積的平均值。以峰面積為縱坐標(biāo)，蘋果酸、檸檬酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，分別繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:蘋果酸Y=66.32X+1.49，檸檬酸Y=87.66X+0.29，相關(guān)系數(shù)分別為0.9996和0.9999。結(jié)果表明，蘋果酸、檸檬酸在0.4648～9.296 μg和1.698～15.282 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.3.4 精密度考察 精密吸取上述蘋果酸和檸檬酸供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣7次，平均峰面積分別為318.0605，RSD為1.63%和744.1637，RSD為1.49%，結(jié)果表明精密度良好。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材五味子按供試品溶液制備項(xiàng)制備，在上述色譜條件下，每隔1 h測(cè)定一次，連續(xù)進(jìn)樣10次，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，蘋果酸平均峰面積165.4521，RSD為2.0%(n=10)；檸檬酸平均峰面積888.0191，RSD為1.41%(n=10)。

3.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)J070805的五味子藥材樣品5份，按供試品溶液制備項(xiàng)制備，在上述色譜條件下，按定量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得蘋果酸和檸檬酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.918%(RSD1.98%)和8.502%(RSD1.98%)。結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

3.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的同一批號(hào)J070805的五味子藥材樣品6份(該批樣品平均含蘋果酸量為1.05%，檸檬酸為8.56%)，分別精密加入蘋果酸和檸檬酸對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備項(xiàng)方法處理，在上述色譜條件下，按定量測(cè)定方法測(cè)定蘋果酸和檸檬酸，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3、4。結(jié)果表明回收率良好。

表3 蘋果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 ()

表3 蘋果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 ()

取樣量/g已知量/mg加入量/mg實(shí)測(cè)量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.2428 2.549 1.698 4.170 95.460.2375 2.494 4.153 97.700.2402 2.522 2.264 4.692 95.85 95.98 1.010.2383 2.502 4.686 96.470.2155 2.263 2.83 4.954 95.090.2207 2.317 5.015 95.33

表4 檸檬酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 6批五味子藥材樣品的定量測(cè)定 取6批五味子藥材按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，每批分別制成3份供試品溶液。在上述色譜條件下，分別注樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果見表5。見圖1～2。

表5 6批藥材定量測(cè)定結(jié)果

圖1 蘋果酸對(duì)照品(A)及五味子藥材中蘋果酸(B)HPLC圖譜

圖2 檸檬酸對(duì)照品(A)及五味子藥材中檸檬酸(A)HPLC圖譜

4 小結(jié)與討論

4.1 在樣品提取處理方面曾采取不同時(shí)間的比較試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明現(xiàn)采取超聲波提取優(yōu)于回流提取60 min已完全能提取有機(jī)酸成分。

4.2 由于蘋果酸和檸檬酸吸收波長(zhǎng)，化學(xué)性質(zhì)相近，故而本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫和適當(dāng)調(diào)節(jié)柱溫的差異，得到成功分離。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:61.

［2］李建平，單安山，程寶晶，等.五味子、檸檬酸對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)和免疫功能的影響［J］.中國畜牧雜志，2009，45(17):25-29.

［3］Hancke J L，Burgos R A，Ahumada F.Schisandra chinensis(Turcz.)Baill［J］.Fitoterapia，1999，70(5):451-471.

［4］Zhu M，Yeung R Y，Lin K F，et al.Improvement of phase I drugmetabolism with Schisandra chinensis against CCl4hepatotoxicity in a rat model［J］.Planta Med，2000，66(6):521-525.

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［6］安天海，王愛英.五味子的綜合質(zhì)量分析［J］.中國林副特產(chǎn)，2009，101(4):39

［7］吳建兵，王譽(yù)潔，趙 鐵，等.電位滴定法測(cè)定五味子中總游離有機(jī)酸［J］.中草藥，2007，38(2):281-282.

［8］張林疆，劉唯芬，畢開順，等.五味子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6(3):219-220.