王吉鴻， 紀(jì)明慧， 舒火明，2*， 宋小平， 肖梓迪

（1.海南師范大學(xué)，省部共建－熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；2.海南經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南 ?？?571127）

沙煲暗羅Polyalthia consanguinea是番荔枝科Annonaceae暗羅屬植物［1］，主要分布于東半球的熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布于云南、廣東、廣西南部、海南及臺(tái)灣。暗羅屬植物在民間已作藥用，具有行氣止痛、行氣散結(jié)的功效，在海南島黎族地區(qū)治療氣滯腹痛、胃疼、痛經(jīng)、梅核氣等［2］。近幾年來(lái)，化學(xué)和藥學(xué)工作者對(duì)暗羅屬植物進(jìn)行了一系列的研究工作，發(fā)現(xiàn)從部分植物中得到的化合物具有一定的抗腫瘤［3］，抗瘧疾［4］，抗肺結(jié)核［4］，抗蟲［5］等藥理活性。但作為海南特有植物的沙煲暗羅，對(duì)其研究未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)沙煲暗羅根部的乙醇提取物進(jìn)行抗氧化活性和抑菌活性研究，從而為沙煲暗羅的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 植物材料 沙煲暗羅采自海南省昌江縣霸王嶺森林公園，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)院鐘瓊?cè)锢蠋熻b定為番荔枝科暗羅屬植物沙煲暗羅Polyalthia consanguinea，樣本保存在海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus sutbtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus nigar)由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物教研室提供。

1.1.3 試劑 石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇(均為分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)；過氧化氫(分析純，西隴化工股份有限公司)；七水合硫酸亞鐵(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；抗壞血酸(Vc)(分析純，廣東汕頭轉(zhuǎn)寧化工廠)；鄰二氮菲(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)；二甲基亞砜(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)；三羥甲基氨基甲烷(分析純，上海山浦化工有限公司)；1，1-二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))；瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改良馬丁購(gòu)于廣東湛江市林達(dá)化玻儀器有限公司。

1.1.4 儀器 超聲波清洗器(KQ2200型，昆山市超聲儀器有限公司)；pH計(jì)(pHS-3C型，上海康儀儀器有限公司)；電子天平(BS124S型，賽多利斯科學(xué)儀器有有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV2600，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司)；手輪式自動(dòng)型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、智能生化培養(yǎng)箱(SPX-250，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇粗提物和不同極性萃取物的制備 將沙煲暗羅根風(fēng)干，粉碎稱質(zhì)量1 kg，用75%乙醇加熱回流3次，每次2 h，合并提取液減壓濃縮得到乙醇浸膏；將浸膏懸濁于水中再依次用石油醚(60～90℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯萃?。粶p壓濃縮分別得石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物，各浸膏冷凍干燥。

1.2.2 清除羥基自由基(OH·)能力 按參考文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取不同部位的樣品溶液10 mg，用二甲基亞砜溶解，分別配制成75、100、125、175、230 μg/mL 的溶液備用。在 10 mL 棕色量瓶中依次加入0.4 mL鄰二氮菲 (5 mmol/L)、1 mL醋酸緩沖溶液 (50 mmol/L pH6.0)、0.4 mL FeSO4(7.5 mmol/L)溶液、0.4 mL H2O2(1%)和不同體積的樣品溶液，用二甲基亞砜定容至10 mL，然后于37℃恒溫水浴反應(yīng)60 min。在536 nm處測(cè)量吸光值A(chǔ)，平行3次。按下公式計(jì)算清除率:

(1)式中:A0為不加雙氧水，而加入樣品時(shí)的吸光度；A1為加入雙氧水，而不加入樣品時(shí)的吸光度；A2為加入雙氧水和樣品時(shí)的吸光度。

1.2.3 清除DPPH自由基能力 按參考文獻(xiàn)［7-10］方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取不同部位的樣品液10 mg，用二甲基亞砜溶解，分別配制成 75，100，125，175，230 μg/mL的溶液備用。取不同體積樣品溶液于10 mL棕色量瓶中，加入1 mL DPPH溶液，用二甲基亞砜定容至10 mL，室溫避光下反應(yīng)30 min。其中1 mL DPPH和9 mL二甲基亞砜A1，VmL樣品，1 mL DPPH和(9-V)mL二甲基亞砜為A2。在517 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)，平行三次。

(2)式中:A1為空白吸收值(t=0 min)；A2為反應(yīng)30 min后的吸光度值

1.2.4 常規(guī)擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果 配制不同質(zhì)量濃度的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取物，分別考察其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的抑制作用，采用常規(guī)擴(kuò)散法［11］即用配好的不同質(zhì)量濃度梯度的待測(cè)溶液浸透濾紙片(濾紙片直徑d=12.56 mm)；待其自然晾干后放入接有菌種的培養(yǎng)皿中。利用其擴(kuò)散作用，使濾紙片上的藥品溶入培養(yǎng)基中。菌種在經(jīng)過24 h或48 h培養(yǎng)后(細(xì)菌培養(yǎng)24 h、真菌培養(yǎng)48 h)，觀察培養(yǎng)皿中有無(wú)抑菌圈，每個(gè)質(zhì)量濃度三個(gè)水平(n=3)，采用十字交叉法測(cè)量其直徑，然后取平均值，測(cè)量其抑菌圈大小，由抑菌圈的有無(wú)來(lái)證明其是否有抑菌作用，并由抑菌圈大小的比較說(shuō)明抑菌作用的強(qiáng)弱。并用固體平板培養(yǎng)基稀釋法［13］測(cè)定最小抑菌質(zhì)量濃度MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙煲暗羅根乙醇提取物的抗氧化活性結(jié)果

2.1.1 清除羥基自由基能力 由圖1和表1得出，四個(gè)部位對(duì)羥基自由基都有一定的清除能力，樣品質(zhì)量濃度增大，清除羥基自由基能力增強(qiáng)。從IC50值可以看出，乙酸乙酯萃取物的清除能力最強(qiáng)，水相最弱，且乙酸乙酯、三氯甲烷和石油醚萃取物的清除能力強(qiáng)于Vc，水相部位較Vc弱。

圖1 清除羥基自由基的能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging activity

表1 清除羥基自由基(OH·)的IC50值Tab.1 IC50values for scavenging hydroxyl radical

2.1.2 清除DPPH自由基能力 由圖2和表2得出，4個(gè)部位對(duì)DPPH都有一定的清除能力，樣品質(zhì)量濃度增大，樣品清除DPPH的能力增強(qiáng)。從IC50值可以看出，乙酸乙酯萃取物的清除能力最強(qiáng)，水相最弱，且4種萃取物的清除能力強(qiáng)于Vc。

綜上所述，4個(gè)部位都有一定的抗氧化活性，與Vc相比，乙酸乙酯萃取物IC50最小，三氯甲烷萃取物次之，再次是石油醚萃取物，水相最大。

圖2 清除DPPH的能力Fig.2 The activity of scavenging DPPH free radical

表2 清除DPPH的IC50值Tab.2 IC50values for scavenging DPPH free radical

2.2 沙煲暗羅根乙醇提取物抑菌實(shí)驗(yàn) 不同質(zhì)量濃度的沙煲暗羅根乙醇提取物的石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物和水相部位對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的抑制作用，結(jié)果見表3?？梢钥闯觯燃淄檩腿∥飳?duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，而對(duì)黑曲霉沒有抑制作用，石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物和水相部位對(duì)以上4種菌種的沒有抑制作用。三氯甲烷萃取物的最小抑菌濃度見表4。

表3 沙煲暗羅根乙醇提取物的抑菌效果Tab.3 The antimicrobial effect of extracts from the root of Polyalthia consanguinea

表4 三氯甲烷萃取物的最小抑菌質(zhì)量濃度Tab.4 The MIC values of the chloroform extract

結(jié)果可知，沙煲暗羅根乙醇提取物石油醚、乙酸乙酯萃取物和水相部位對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉無(wú)明顯抑制作用，三氯甲烷萃取物對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，對(duì)黑曲霉無(wú)抑制作用。從表4看出，三氯甲烷萃取物質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng)，其MIC為20 mg/mL，同時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為40 mg/mL。

3 討論

沙煲暗羅根乙醇提取物不同極性萃取物都有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)羥基自由基和DPPH活性最好，其IC50值分別為110.8、156.5 μg/mL，三氯甲烷萃取物次之，再次是石油醚萃取物，水相活性最后；同時(shí)，三氯甲烷萃取物有明顯的抑菌效果，對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌最小抑菌質(zhì)量濃度均為20 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為40 mg/mL。這表明通過萃取可以有效富積沙煲暗羅根抗氧化和抗菌成分，并且并非單一成分。這一結(jié)果為之后對(duì)其有效成分的分離鑒定提供了導(dǎo)向，同時(shí)為沙煲暗羅根中的天然抗氧化和抑菌物質(zhì)及以其為原料的藥品、食品的開發(fā)和研究提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)填補(bǔ)了沙煲暗羅抗氧化和抑菌研究的空白，為進(jìn)一步研究該植物提供了基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

［1］中國(guó)科學(xué)院華南植物研究所.海南植物志:第1卷［M］.北京:科學(xué)出版社，1964:247.

［2］張 園，王 菁，劉冰晶，等.海南四種暗羅屬植物揮發(fā)油對(duì)三種癌細(xì)胞的體外增殖抑制作用［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(15):62-64.

［3］Ma X，Lee I S，Chai H B，et al.Cytotoxic clerodane diterpenes from Polyalthia barnesii［J］.Phytochemistry，1994，37(6):1659-1662

［4］Kanokmedhakul S，Kanokmedhakul K，Lekphrom R.Bioactive constituents of the roots of Polyalthia cerasoides［J］.J Nat Product，2007，70(9):1536-1538.

［5］Ngantchou I，Nyasse B，Denier C，et al.Antitrypanosomal alkaloids from Polyalthia suaveolens(Annonaceae):Their effects on three selected glycolytic enzymes of Trypanosoma brucei［J］.Bioorg Med Chem Lett，2010，20(12):3495-3498.

［6］劉慧燕，趙謀明.江蘺低分子多糖的提取以及抗氧化的研究［J］.食品工業(yè)科技，2005，26(3):67-69.

［7］黃美娥，卓儒洞，唐 莉.紫花地丁乙醇提取物的抗氧化性研究［J］.食品科技，2007(2):152-154.

［8］孟 潔，杭 瑚.虎杖提取物的抗氧化活性及穩(wěn)定性研究［J］.化學(xué)世界，2000(8):418-421.

［9］王 琪，田迪英，楊榮華.果蔬抗氧化活性測(cè)定方法的比較［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):166-168.

［10］豐永紅，于淑娟，李國(guó)基，等.DPPH法測(cè)甘蔗提取物抗氧化活性研究［J］.甘蔗糖業(yè)，2003(1):31-35.

［11］方美珠，晁群芳，蘭 雁，等.新疆一枝蒿提取物抑菌作用的研究［J］.食品科技，2011，36(1):160-162，166

［12］劉 平，段玉峰，肖 紅，等.崖柏乙醇提取物抑菌作用的初步研究［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)報(bào)，2011，31(4):66-69.