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        沙煲暗羅根乙醇提取物的抗氧化活性和抗菌活性研究

        2012-11-01 14:07:56王吉鴻紀(jì)明慧舒火明宋小平肖梓迪
        中成藥 2012年4期

        王吉鴻, 紀(jì)明慧, 舒火明,2*, 宋小平, 肖梓迪

        (1.海南師范大學(xué),省部共建-熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ???571158;2.海南經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,海南 ???571127)

        沙煲暗羅Polyalthia consanguinea是番荔枝科Annonaceae暗羅屬植物[1],主要分布于東半球的熱帶及亞熱帶地區(qū),我國(guó)主要分布于云南、廣東、廣西南部、海南及臺(tái)灣。暗羅屬植物在民間已作藥用,具有行氣止痛、行氣散結(jié)的功效,在海南島黎族地區(qū)治療氣滯腹痛、胃疼、痛經(jīng)、梅核氣等[2]。近幾年來(lái),化學(xué)和藥學(xué)工作者對(duì)暗羅屬植物進(jìn)行了一系列的研究工作,發(fā)現(xiàn)從部分植物中得到的化合物具有一定的抗腫瘤[3],抗瘧疾[4],抗肺結(jié)核[4],抗蟲[5]等藥理活性。但作為海南特有植物的沙煲暗羅,對(duì)其研究未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)沙煲暗羅根部的乙醇提取物進(jìn)行抗氧化活性和抑菌活性研究,從而為沙煲暗羅的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑和儀器

        1.1.1 植物材料 沙煲暗羅采自海南省昌江縣霸王嶺森林公園,經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)院鐘瓊?cè)锢蠋熻b定為番荔枝科暗羅屬植物沙煲暗羅Polyalthia consanguinea,樣本保存在海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

        1.1.2 供試菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus sutbtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus nigar)由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物教研室提供。

        1.1.3 試劑 石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇(均為分析純,天津市化學(xué)試劑一廠);過氧化氫(分析純,西隴化工股份有限公司);七水合硫酸亞鐵(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);抗壞血酸(Vc)(分析純,廣東汕頭轉(zhuǎn)寧化工廠);鄰二氮菲(分析純,天津市化學(xué)試劑一廠);二甲基亞砜(分析純,天津市化學(xué)試劑一廠);三羥甲基氨基甲烷(分析純,上海山浦化工有限公司);1,1-二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn));瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改良馬丁購(gòu)于廣東湛江市林達(dá)化玻儀器有限公司。

        1.1.4 儀器 超聲波清洗器(KQ2200型,昆山市超聲儀器有限公司);pH計(jì)(pHS-3C型,上海康儀儀器有限公司);電子天平(BS124S型,賽多利斯科學(xué)儀器有有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(UV2600,北京普析通用儀器責(zé)任有限公司);手輪式自動(dòng)型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS,上海申安醫(yī)療器械廠)、智能生化培養(yǎng)箱(SPX-250,寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 乙醇粗提物和不同極性萃取物的制備 將沙煲暗羅根風(fēng)干,粉碎稱質(zhì)量1 kg,用75%乙醇加熱回流3次,每次2 h,合并提取液減壓濃縮得到乙醇浸膏;將浸膏懸濁于水中再依次用石油醚(60~90℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯萃?。粶p壓濃縮分別得石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物,各浸膏冷凍干燥。

        1.2.2 清除羥基自由基(OH·)能力 按參考文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取不同部位的樣品溶液10 mg,用二甲基亞砜溶解,分別配制成75、100、125、175、230 μg/mL 的溶液備用。在 10 mL 棕色量瓶中依次加入0.4 mL鄰二氮菲 (5 mmol/L)、1 mL醋酸緩沖溶液 (50 mmol/L pH6.0)、0.4 mL FeSO4(7.5 mmol/L)溶液、0.4 mL H2O2(1%)和不同體積的樣品溶液,用二甲基亞砜定容至10 mL,然后于37℃恒溫水浴反應(yīng)60 min。在536 nm處測(cè)量吸光值A(chǔ),平行3次。按下公式計(jì)算清除率:

        (1)式中:A0為不加雙氧水,而加入樣品時(shí)的吸光度;A1為加入雙氧水,而不加入樣品時(shí)的吸光度;A2為加入雙氧水和樣品時(shí)的吸光度。

        1.2.3 清除DPPH自由基能力 按參考文獻(xiàn)[7-10]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取不同部位的樣品液10 mg,用二甲基亞砜溶解,分別配制成 75,100,125,175,230 μg/mL的溶液備用。取不同體積樣品溶液于10 mL棕色量瓶中,加入1 mL DPPH溶液,用二甲基亞砜定容至10 mL,室溫避光下反應(yīng)30 min。其中1 mL DPPH和9 mL二甲基亞砜A1,VmL樣品,1 mL DPPH和(9-V)mL二甲基亞砜為A2。在517 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ),平行三次。

        (2)式中:A1為空白吸收值(t=0 min);A2為反應(yīng)30 min后的吸光度值

        1.2.4 常規(guī)擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果 配制不同質(zhì)量濃度的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取物,分別考察其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的抑制作用,采用常規(guī)擴(kuò)散法[11]即用配好的不同質(zhì)量濃度梯度的待測(cè)溶液浸透濾紙片(濾紙片直徑d=12.56 mm);待其自然晾干后放入接有菌種的培養(yǎng)皿中。利用其擴(kuò)散作用,使濾紙片上的藥品溶入培養(yǎng)基中。菌種在經(jīng)過24 h或48 h培養(yǎng)后(細(xì)菌培養(yǎng)24 h、真菌培養(yǎng)48 h),觀察培養(yǎng)皿中有無(wú)抑菌圈,每個(gè)質(zhì)量濃度三個(gè)水平(n=3),采用十字交叉法測(cè)量其直徑,然后取平均值,測(cè)量其抑菌圈大小,由抑菌圈的有無(wú)來(lái)證明其是否有抑菌作用,并由抑菌圈大小的比較說(shuō)明抑菌作用的強(qiáng)弱。并用固體平板培養(yǎng)基稀釋法[13]測(cè)定最小抑菌質(zhì)量濃度MIC。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 沙煲暗羅根乙醇提取物的抗氧化活性結(jié)果

        2.1.1 清除羥基自由基能力 由圖1和表1得出,四個(gè)部位對(duì)羥基自由基都有一定的清除能力,樣品質(zhì)量濃度增大,清除羥基自由基能力增強(qiáng)。從IC50值可以看出,乙酸乙酯萃取物的清除能力最強(qiáng),水相最弱,且乙酸乙酯、三氯甲烷和石油醚萃取物的清除能力強(qiáng)于Vc,水相部位較Vc弱。

        圖1 清除羥基自由基的能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging activity

        表1 清除羥基自由基(OH·)的IC50值Tab.1 IC50values for scavenging hydroxyl radical

        2.1.2 清除DPPH自由基能力 由圖2和表2得出,4個(gè)部位對(duì)DPPH都有一定的清除能力,樣品質(zhì)量濃度增大,樣品清除DPPH的能力增強(qiáng)。從IC50值可以看出,乙酸乙酯萃取物的清除能力最強(qiáng),水相最弱,且4種萃取物的清除能力強(qiáng)于Vc。

        綜上所述,4個(gè)部位都有一定的抗氧化活性,與Vc相比,乙酸乙酯萃取物IC50最小,三氯甲烷萃取物次之,再次是石油醚萃取物,水相最大。

        圖2 清除DPPH的能力Fig.2 The activity of scavenging DPPH free radical

        表2 清除DPPH的IC50值Tab.2 IC50values for scavenging DPPH free radical

        2.2 沙煲暗羅根乙醇提取物抑菌實(shí)驗(yàn) 不同質(zhì)量濃度的沙煲暗羅根乙醇提取物的石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物和水相部位對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的抑制作用,結(jié)果見表3??梢钥闯觯燃淄檩腿∥飳?duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,而對(duì)黑曲霉沒有抑制作用,石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物和水相部位對(duì)以上4種菌種的沒有抑制作用。三氯甲烷萃取物的最小抑菌濃度見表4。

        表3 沙煲暗羅根乙醇提取物的抑菌效果Tab.3 The antimicrobial effect of extracts from the root of Polyalthia consanguinea

        表4 三氯甲烷萃取物的最小抑菌質(zhì)量濃度Tab.4 The MIC values of the chloroform extract

        結(jié)果可知,沙煲暗羅根乙醇提取物石油醚、乙酸乙酯萃取物和水相部位對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉無(wú)明顯抑制作用,三氯甲烷萃取物對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,對(duì)黑曲霉無(wú)抑制作用。從表4看出,三氯甲烷萃取物質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí),大腸桿菌和枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng),其MIC為20 mg/mL,同時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為40 mg/mL。

        3 討論

        沙煲暗羅根乙醇提取物不同極性萃取物都有一定的抗氧化活性,其中乙酸乙酯萃取物對(duì)羥基自由基和DPPH活性最好,其IC50值分別為110.8、156.5 μg/mL,三氯甲烷萃取物次之,再次是石油醚萃取物,水相活性最后;同時(shí),三氯甲烷萃取物有明顯的抑菌效果,對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌最小抑菌質(zhì)量濃度均為20 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為40 mg/mL。這表明通過萃取可以有效富積沙煲暗羅根抗氧化和抗菌成分,并且并非單一成分。這一結(jié)果為之后對(duì)其有效成分的分離鑒定提供了導(dǎo)向,同時(shí)為沙煲暗羅根中的天然抗氧化和抑菌物質(zhì)及以其為原料的藥品、食品的開發(fā)和研究提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)填補(bǔ)了沙煲暗羅抗氧化和抑菌研究的空白,為進(jìn)一步研究該植物提供了基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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