何 平,張 健,池玉杰

(東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040)

乳白耙齒菌(Irpexlacteus)又名白囊耙齒菌[1]，隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycets)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、耙齒菌屬(Irpex)[2]，它屬于白腐菌的一種，一般生于闊葉樹的枝條上[3]。研究顯示白腐菌可以產(chǎn)生木質素過氧化物酶，漆酶和錳過氧化物酶，其中錳過氧化物酶[Manganese peroxidase (MnP)]，既可以氧化木質素中的酚類結構單元又可以氧化非酚類的結構單元，是一種高效的木質素降解酶[4]，而霉菌、細菌和酵母菌等都不產(chǎn)生錳過氧化物酶。據(jù)研究MnP不僅可以降解木材中的木質素應用于造紙業(yè)，還可以對染料等有毒酚類物質進行降解脫色并應用于工業(yè)廢水治理，因此近些年來MnP被廣泛應用及研究。而錳過氧化物酶是一種誘導酶類，其合成水平不僅與菌株本身的產(chǎn)酶能力密切相關，同時還受不同的培養(yǎng)條件[5-7]、特別是誘導劑的影響。而根據(jù)誘導途徑的不同可將誘導劑分為3類，首先是易被代謝的底物，如果糖，葡萄糖等可以提供生長能源和電子來源的物質；其次是與降解底物有相似結構的物質，這些物質既是誘導底物，又是降解底物；第三種是酶結構有關的誘導物，可促進酶的產(chǎn)生，如Cu2+、Mn2+、血紅素等。比如添加適量的金屬離子Mn2+對大多數(shù)真菌MnP的產(chǎn)量有很大的誘導作用，因為Mn2+存在于MnP酶蛋白的活性位點上，會影響MnP基因的表達轉錄，所以也是MnP分泌的必要誘導劑。本研究檢測了各種類型誘導劑對乳白耙齒菌的產(chǎn)MnP活性的作用，進一步完善了乳白耙齒菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，對完善乳白耙齒菌最優(yōu)培養(yǎng)基，使Irpexlacteus高效產(chǎn)出MnP具有重要意義，為造紙工業(yè)中生物制漿技術的進一步研究應用及環(huán)境中有害物質的降解等問題的解決提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源、培養(yǎng)基與菌種復壯

本研究中試驗菌種乳白耙齒菌(Irpexlacteus)由東北林業(yè)大學林學院森林保護學科森林病蟲病理實驗室提供，試驗前菌種保存在Potato Dextrose Agar (PDA) 培養(yǎng)基斜面上，冷藏于4 ℃ 冰箱中。

取出保存在PDA斜面培養(yǎng)基上的乳白耙齒菌(Irpexlacteus)，在室溫下靜置24 h后，轉接入新的PDA平板培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)，6 d左右菌絲長滿整個平板。此時菌種的生長勢最旺盛，作為后續(xù)試驗供試菌株。

1.2 初始Irpex lacteus產(chǎn)MnP活性的測定

將生長在PDA培養(yǎng)基6 d的Irpexlacteus菌株轉接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)5，7，9，11，13，15，17，20 d時提取酶液，測定MnP活性。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(L-1)：葡萄糖10 g，酒石酸銨6 mmol，MnSO4·H2O 0.030 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO40.2 g，吐溫80 1 mL，礦物元素溶液(L-1):Ferric-citrate·H2O 0.087 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g,MnSO4·H2O 0.45 g,CoCl2·6H2O 0.1 g,CuSO4·5H2O 0.01 g 10 mL，維生素溶液(L-1):D-biotin 0.002 g,Folic acid 0.002 g,Thiamine·HCl 0.005 g,Riboflavin 0.005 g,Pyridoxine·HCl 0.01 g,Cyanocobalamin 0.000 1 g,Nicotinic acid 0.005,Calsium Pantothenate 0.005,P-aminobenzoic acid 0.005,DL-6,8-thioctic acid 0.005)1 mL,pH值為7。

MnP活性測定方法，在37 ℃條件下，測定體系1 mL,其中pH=4.5的丙二酸鈉緩沖液(50 mmol/L) 840 μL，MgSO4溶液(10 mmol/L) 50 μL，2,6-DMP溶液(10 mmol/L) 50 μL，待測酶液50 μL，H2O2溶液(10 mmol/L) 10 μL，以1 mL去離子水作為對照，測定470 nm處吸光度在1 min內的變化值。上述條件下，每分鐘催化1 μmol 2,6-DMP所需的酶量。酶活計算公式如下：MnP活力=[106×V1×ΔA×N]/[V2×ε470×Δt]。計算中ε470=49 600[(mol/L)·cm]-1。

1.3 誘導劑對錳過氧化物酶活性的誘導

1.3.1 單獨誘導劑的初篩選試驗 參考相關文獻[10-14]，本研究共選擇12種2大類誘導劑作為Irpexlacteus產(chǎn)MnP的誘導劑，其中生物誘導劑2種：麥麩和木屑；化學誘導劑10種：愈創(chuàng)木酚、苯酚、香蘭素、藜蘆醇、苯甲酸、沒食子酸、酪氨酸、二甲苯、苯胺藍和ABTS。麥麩和木屑的添加量均為1.5%，在初始配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基時加入；其他化學誘導劑配制成高濃度母液過濾除菌，在Irpexlacteus在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第3天時加入，使誘導劑添加的終濃度均為0.5 mmol/L。以不加誘導劑的初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液為對照，每組重復3次，隔天測定MnP活性，獲得各單項誘導劑的MnP活性曲線，進而初步篩選出對Irpexlacteus產(chǎn)MnP誘導效果好的生物和化學誘導劑。

1.3.2 誘導劑濃度單因素試驗 根據(jù)各單項誘導劑的誘導結果，篩選出誘導Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性較高的誘導劑，進行最佳誘導劑的不同濃度單因素試驗，測定MnP活性，以確定該誘導劑的最適添加量。

1.3.3 誘導劑組合及Mn2+濃度對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的影響 測定兩種最佳誘導劑在最適濃度下，同時添加時對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的影響，確定誘導劑組合效果是否優(yōu)于單項誘導劑誘導MnP的產(chǎn)生。

再添加最佳誘導劑組合的基礎上改變Mn2+濃度，檢測MnP活性，確定Mn2+最適添加量。綜合分析最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方。

2 結果與分析

2.1 初始Irpex lacteus產(chǎn)錳過氧化物酶活性的測定

圖1 Irpex lacteus產(chǎn)MnP活性Fig.1 MnP activity of Irpex lacteus

在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的條件下，檢測了在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中Irpexlacteus的MnP活性，得到的結果(圖1)所示可以看出，Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性在第5天到第7天急劇上升，最高峰在第7天時出現(xiàn)此時MnP活性為12.7 U/L，MnP活性由1.81 U/L急劇上升至12.7 U/L上漲約7倍，第7天到第9天MnP活性急劇下降，在第9天到第20天期間MnP活性變化趨于平穩(wěn)在3.7 U/L至5.8 U/L之間浮動。

1：麥麩；2：木屑；3：愈創(chuàng)木酚；4：苯酚；5：香蘭素；6：藜蘆醇；7：苯甲酸；8：沒食子酸；9：酪氨酸；10：二甲苯；11：苯胺藍；12：ABTS；13：對照組1:wheat bran;2:sawdust;3:guaiacol;4:phenol;5:vanillin;6:veratryl alcohol;7:benzoic acid;8:gallic acid;9:tyrosine;10:xylene;11:aniline blue;12:ABTS;13:control group圖2 17 d時誘導劑對錳過氧化物酶活性的影響Fig.2 Effect of 17-day inducer on manganese peroxidase activity

2.2 誘導劑的篩選試驗

本試驗所選擇的12種誘導劑對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的誘導效果不同，通過隔天測定各MnP活性的方式分析各誘導劑效果，從表1可以確定第17天為誘導劑誘導Irpexlacteus產(chǎn)MnP高峰。12種誘導劑在第17天時對誘導Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的誘導結果(圖2)可以看出，化學誘導劑中ABTS的誘導效果最好，此時MnP的酶活為145.161 U/L，是在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中對照培養(yǎng)酶活(13.306 U/L)的11倍；其次為沒食子酸，是對照酶活的5.6倍。其他誘導劑的誘導效果一般。對于2種生物誘導劑麥麩和木屑來說，產(chǎn)酶高峰為13 d，在13 d時酶活分別為104.234 U/L、48.992 U/L，分別是對照酶活的8.6倍、4.1倍，可見麥麩的誘導效果優(yōu)于木屑。根據(jù)以上結果選擇出對乳白耙齒菌錳過氧化物酶活性的誘導較好的誘導劑為麥麩、ABTS和沒食子酸。

2.3 誘導劑濃度單因素試驗

通過單項誘導劑的篩選，選擇了誘導效果最好的生物誘導劑麥麩和化學誘導劑的ABTS，進行最佳誘導劑不同濃度的單因素試驗，以確定該誘導劑的最適添加量。麥麩添加量設置3個濃度梯度，分別為1%、1.5%和2%，化學誘導劑ABTS的添加量設置了共6個濃度梯度，分別為0.05，0.2，0.5，1，1.5，2 mmol/L，以不加誘導劑的初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液為對照，每組重復3次，隔天測定錳MnP活性，分別得到了不同濃度的麥麩和ABTS對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的誘導結果。從表2看出除濃度為1.5 mmol/L和2.0 mmol/L麥麩培養(yǎng)的產(chǎn)酶高峰為第13天和第15天外，其他濃度的ABTS在第19天時對MnP的誘導效果都達到最好，而且MnP活性平均值均高過濃度為1.5 mmol/L和2.0 mmol/L時。麥麩培養(yǎng)的產(chǎn)酶高峰均出現(xiàn)在第13天，圖3顯示了不同濃度的ABTS在第19天時對錳過氧化物酶的誘導結果，圖4顯示了不同濃度的麥麩在第13天時對錳過氧化物酶的誘導結果。

表1 12種誘導劑對錳過氧化物酶活性的影響

表2 麥麩和ABTS濃度對錳過氧化物酶活性的影響

由圖3可知，不加ABTS，MnP的活性很低；加入少量的ABTS(0.05 mmol/L)，MnP的活性顯著提高，也表明了ABTS對MnP的顯著誘導能力，當ABTS濃度為0.2 mmol/L時誘導的MnP活性達到最高，酶活為193.347 U/L，是對照酶活的14.5倍，高過了1.5%的麥麩對MnP的誘導效果，但ABTS濃度增加到0.5 mmol/L時，MnP的活性就開始下降了，說明過高濃度的ABTS不利于菌體產(chǎn)生MnP，同時也說明過高濃度ABTS對菌絲體也有毒害作用。由圖4可以看出，不加麥麩，MnP的活性很低；加入1%的麥麩，MnP的活性顯著提高，表明麥麩對MnP有顯著誘導能力，麥麩含量為1.5%培養(yǎng)時間為13 d時，MnP的酶活性最高，為99.395 U/L；但麥麩含量升高到2%時，MnP的活性又下降，可能是麥麩含量過高影響了培養(yǎng)基中的含氧量，導致菌體生長欠佳，不利于MnP的合成。

圖3 ABTS濃度對錳過氧化物酶活性的影響Fig.3 Effect of ABTS concentration on manganese peroxidase activity

圖4 麥麩含量對錳過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effect of wheat bran content on manganese peroxidase activity

2.4 Mn2+濃度及誘導劑組合對Irpex lacteus產(chǎn)MnP活性的影響

在不加Mn2+和添加0.2 mmol/L Mn2+的情況下，分別檢測了麥麩和ABTS 2種最佳誘導劑在最適濃度下單獨添加和同時添加時Irpexlacteus的MnP活性，發(fā)現(xiàn)兩種誘導劑組合的情況下，Irpexlacteus的產(chǎn)酶高峰變?yōu)榈?7天，在第17天的酶活結果如圖5所示，從圖中可以看出：無論是否添加Mn2+，同時添加麥麩和ABTS 2種誘導劑，比單獨添加其中1種誘導劑的MnP活性高，即麥麩和ABTS這2種誘導劑組合的誘導效果優(yōu)于任何1個單項誘導劑；在含有0.2 mmol/L Mn2+的情況下，無論是單項誘導劑還是2種誘導劑組合，都比不添加Mn2+的誘導效果更好，最高的錳過氧化物酶活性出現(xiàn)在含有0.2 mmol/L Mn2+，同時添加1.5%麥麩和0.2 mmol/L ABTS時，此時錳過氧化物酶活性為203.226 U/L，是對照酶活的21.9倍。因此確定同時添加Mn2+和1.5%麥麩和0.2 mmol/L ABTS為最佳誘導劑組合。

圖6顯示了在培養(yǎng)液內添加最佳誘導劑組合的同時，添加不同濃度Mn2+的MnP活性在17 d時的變化情況。Mn2+的濃度設置了6個濃度梯度，分別為0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，3.0 mmol/L。結果表明Mn2+的濃度不同，錳過氧化物酶的活性也不同，基本上是低濃度促進，較高濃度對產(chǎn)酶也有促進作用，但效率降低。當Mn2+濃度在0～0.2 mmol/L期間時錳過氧化物酶活性隨Mn2+濃度增加而增加，在0.2 mmol/L時活性達到最高，Mn2+濃度超過0.2 mmol/L后活性隨Mn2+濃度增加而逐漸下降，但比不加Mn2+的對照組時酶活性高，分析原因是Mn2+為重金屬離子，過高Mn2+濃度對菌體有毒性，對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，同時也抑制了菌體對錳過氧化物酶的分泌。

圖5 2種誘導劑組合對MnP活性的影響Fig.5 Effect of two inducers on MnP activity

圖6 Mn2+濃度對MnP活性的影響Fig.6 Effect of Mn2 + concentration on MnP activity

3 結論與討論

在乳白耙齒菌產(chǎn)MnP的過程中，加入一些與木質素結構相似的化合物做為誘導劑，如酚類或者芳香族化合物能大大提高MnP的產(chǎn)量，誘導劑的種類和添加量對MnP活性都有顯著影響[11]。因此，誘導劑及用量的選擇是MnP優(yōu)化工藝中非常關鍵的步驟而不可或缺。本實驗共選擇12種底物作為白腐菌乳白耙齒菌(Irpexlacteus)產(chǎn)MnP的誘導劑，進行了單項誘導劑的篩選試驗、最佳單項誘導劑濃度的單因素試驗，2種最佳誘導劑組合、Mn2+濃度對MnP活性的影響試驗等，通過逐級篩選結果表明：在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L Mn2+的情況下，生物誘導劑麥麩和化學誘導劑ABTS誘導的Irpexlacteus產(chǎn)MnP酶活高、效果好，在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)Irpexlacteus分別加入1.5%的麥麩和0.2 mmol/L的ABTS，在產(chǎn)酶高峰時MnP酶活分別是初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)Irpexlacteus酶活的8.6倍和11倍；而這兩種最佳誘導劑在最適濃度下組合的誘導效果又優(yōu)于使用任何一種單項誘導劑，即同時添加1.5%麥麩與0.2 mmol/L ABTS誘導劑效果更好，在28 ℃靜置培養(yǎng)的條件下，酶活峰值可達203.226 U/L，是初始培養(yǎng)條件錳過氧化物酶活性的21.9倍，表明誘導劑能大幅度地提高Irpexlacteus的錳過氧化物酶活性。因此，得出乳白耙齒菌Irpexlacteus產(chǎn)錳過氧化物酶的最適條件：在100 mL三角瓶中加入初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基30 mL，其中添加1.5%麥麩，接入3塊直徑9 mm的菌餅，在28 ℃下靜置培養(yǎng)培養(yǎng)3 d后，再添加0.2 mmol/L的Mn2+和0.2 mmol/L的ABTS，繼續(xù)在28 ℃下靜置培養(yǎng)17 d達到其產(chǎn)酶高峰。此時錳過氧化物酶活性為203.226 U/L，是對照酶活的21.9倍。王忠艷等[15]對乳白耙齒菌最佳培養(yǎng)及配方進行了優(yōu)化研究，楊曉寬等[16]對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶培養(yǎng)基的優(yōu)化做了研究，本文在該研究的基礎上進行誘導劑實驗，使MnP的活性得到了提高，表明乳白耙齒菌(Irpexlacteus)所產(chǎn)得MnP是一種誘導型酶，其合成不僅易受培養(yǎng)條件的影響，更受到誘導劑的影響，適宜的誘導劑能大幅度地提高乳白耙齒菌(Irpexlacteus)的MnP活性。