溫 敏， 李艷萍， 何 鵬， 趙 遠(yuǎn)

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137； 2.云南省中醫(yī)中藥研究院， 云南 昆明 650223；3.云南省騰沖縣人民醫(yī)院， 云南 騰沖 679100)

目前艾滋病流行態(tài)勢(shì)依然嚴(yán)峻，截至2011年底，估計(jì)中國(guó)存活HIV感染者和AIDS患者(PLHIV)78萬人，其中艾滋病(AIDS)患者15.4萬人，云南省是中國(guó)艾滋病流行最嚴(yán)重的地區(qū)之一[1]。HAART是艾滋病治療的主要手段，能顯著降艾滋病患者的HIV病毒載量和增加CD4+T細(xì)胞數(shù)量[2～3]，臨床實(shí)踐表明中醫(yī)藥在改善艾滋病患者的臨床癥狀和改善患者生存質(zhì)量方面效果明確。那么在HAART聯(lián)合中藥對(duì)HIV病毒載量被有效抑制的HIV/AIDS患者的NK細(xì)胞的變化趨勢(shì)有何干預(yù)作用？因此本文將通過臨床隨機(jī)雙盲試驗(yàn)研究，觀察HAART聯(lián)合中藥對(duì)HIV-1病毒載量被有效抑制后的NK細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，初步闡釋HAART聯(lián)合中藥治療HIV/AIDS的優(yōu)勢(shì)和可能作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 126名HIV/AIDS患者來自云南省騰沖、祥云縣人民醫(yī)院國(guó)家免費(fèi)艾滋病抗病毒治療時(shí)間至少6個(gè)月以上，進(jìn)行HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸治療前HIV-1病毒載量均低于檢測(cè)限(50拷貝/mL)。遵循臨床隨機(jī)雙盲試驗(yàn)原則將126名符合入組條件的HIV/AIDS患者分為HAART+中藥(康愛保生濃縮丸)組和HAART+中藥組。

1.2 試驗(yàn)用藥物 HAART藥物為國(guó)家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物。中藥為康愛保生丸濃縮丸，系云南省中醫(yī)中藥研究院附屬醫(yī)院制劑，并用于云南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目的中藥院內(nèi)制劑(批準(zhǔn)文號(hào)為滇藥制字Z20090006A)。該劑處方由紫花地丁、黃芩、桑白皮、人參組成。具有解毒清熱，活血祛濕，養(yǎng)陰益氣等功效。服用方法：6 g/次，1日4次，有效期36個(gè)月。由云南省中醫(yī)中藥研究院提供。

1.3 隨訪時(shí)間 2010年4月～2011年5月，在臨床隨機(jī)雙盲試驗(yàn)的0、3、6、9、12月進(jìn)行隨訪，檢測(cè)NK細(xì)胞。

1.4 NK細(xì)胞計(jì)數(shù) 用FC500流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記檢測(cè)。所用單克隆抗體及其組合為：CD3/CD16±56/。加入20 μL試劑和100 μL Flow-Count 熒光微球至管底，加入100 μL混合均勻的受試對(duì)象抗凝全血至管底，輕柔振蕩混勻后室溫避光孵育15 min，加入450 μL FACS Lysing solution溶解紅細(xì)胞，室溫溶血6～12 min。1700 r/min離心5 min，倒掉上清，用1%小牛血清洗液2 mL洗滌，1700 r/min離心5 min后，倒掉上清，加入600 μL 1%多聚甲醛固定液，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 15.0軟件包處理所有的數(shù)據(jù)，CD4+T細(xì)胞基線、CD8+T細(xì)胞基線、入組時(shí)年齡、HAART持續(xù)時(shí)間、NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)用中位數(shù)(四分衛(wèi)數(shù))表示。分組比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。雙側(cè)有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 入組HIV/AIDS患者一般人口學(xué)資料 126例HIV-1AIDS的一般人口學(xué)資料見表1。按照入組時(shí)隨機(jī)雙盲原則進(jìn)行分組，分別給予HAART聯(lián)合中藥(康愛保生濃縮丸)、HAART+安慰劑兩種不同干預(yù)措施，兩組各因素的差異沒有顯著性意義(P>0.05)，見表1。

表1 126例AIDS患者分組的一般人口學(xué)資料

2.2 HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸對(duì)NK細(xì)胞的干預(yù)作用 在0月時(shí)HAART+康愛保生濃縮丸組和HAART+安慰劑組的NK細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)的差異有顯著性意義(P=0.012)，經(jīng)過12月的治療，兩組在各隨訪點(diǎn)的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)總體逐漸增長(zhǎng)，從第9個(gè)月開始HAART+中藥組的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)大于HAART+安慰劑組，在12月時(shí)兩組的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)細(xì)胞的差異有顯著性意義(P=0.032)，結(jié)果見表2。

表2 HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸對(duì)HIV-1病毒載量有效抑制下的NK細(xì)胞的干預(yù)作用研究

注：2組比較，*P<0.05

根據(jù)入組時(shí)CD4+T細(xì)胞數(shù)量將HAART+康愛保生濃縮丸組和HAART+安慰劑組分為CD4+T細(xì)胞基線<200個(gè)/μL和CD4+T細(xì)胞基線≥200個(gè)/μL兩層進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

CD4+T細(xì)胞基線≥200個(gè)/μL層：在各隨訪時(shí)間點(diǎn)HAART+安慰劑組和HAART+康愛保生濃縮丸組的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)分別為：0月，194個(gè)/μL(128～320個(gè)/μL)，173個(gè)/μL(118～282個(gè)/μL)；3月，163個(gè)/μL(125～265個(gè)/μL)，210個(gè)/μL(174～328個(gè)/μL)；6月，214個(gè)/μL(130～409個(gè)/μL)，234個(gè)/μL(154～380個(gè)/μL)；9月，335個(gè)/μL(203～424個(gè)/μL)，292個(gè)/μL(218～367個(gè)/μL)；12月，385個(gè)/μL(266～704個(gè)/μL)，475(266～574個(gè)/μL)。

CD4+T細(xì)胞基線<200個(gè)/μL層：在各隨訪時(shí)間點(diǎn)HAART+安慰劑組和HAART+康愛保生濃縮丸組的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)分別為：0月，157個(gè)/μL(106～210個(gè)/μL)，138個(gè)/μL(94～309)個(gè)/μL；3月，163個(gè)/μL(125～265個(gè)/μL)，210個(gè)/μL(174～328個(gè)/μL)；6月，172個(gè)/μL(122～437個(gè)/μL)，214個(gè)/μL(130～409個(gè)/μL)；9月，250個(gè)/μL(180～384個(gè)/μL)，292個(gè)/μL(200～345個(gè)/μL)；12月，372個(gè)/μL(189～574個(gè)/μL)，469個(gè)/μL(230～604個(gè)/μL)。結(jié)果顯示入組CD4+T細(xì)胞基線<200個(gè)/μL的HIV/AIDS患者在12個(gè)月的隨訪過程中HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸組的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)比HAART+安慰劑組的明顯(圖1)。

圖1 入組CD4+T細(xì)胞基線<200個(gè)/μL層的HAART聯(lián)合中藥和HAART+安慰劑組的CD4+T細(xì)胞變化趨勢(shì)

3 討論

從2004年全國(guó)開始實(shí)行中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目以來，對(duì)全國(guó)9000多例臨床資料總結(jié)可以明確中醫(yī)藥可以明顯減輕發(fā)熱、乏力、氣短、咳嗽、腹瀉、皮疹等癥狀，增加患者體重，恢復(fù)部分患者的勞動(dòng)能力，提高患者的生存質(zhì)量。但中醫(yī)藥治療HIV/AIDS研究仍有局限性，主要體現(xiàn)在(1)中醫(yī)藥治療HIV/AIDS效果緩慢、效果不穩(wěn)定；(2)中醫(yī)藥治療HIV/AIDS靶點(diǎn)不明確，對(duì)其作用機(jī)制的研究較少。那么中醫(yī)藥除改善臨床癥狀外介入艾滋病治療的切入點(diǎn)何在，有何優(yōu)勢(shì)？HAART聯(lián)合中藥是否對(duì)NK細(xì)胞有干預(yù)作用？

NK細(xì)胞(natural killer cell，自然殺傷細(xì)胞)是天然免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要的組成部分，是一類來源于骨髓的大顆粒淋巴細(xì)胞，在正常外周血中大約占單個(gè)核細(xì)胞成分的10%～15%，是免疫防御的第一道防線，NK細(xì)胞在抗病毒、抗腫瘤中發(fā)揮著極其重要的作用[4]。NK細(xì)胞分為三個(gè)亞群，即：CD56dimCD16+、CD56briCD16+/-和CD56-CD16+NK細(xì)胞。CD56dimCD16+NK細(xì)胞占外周血NK細(xì)胞的80～90%，通過與細(xì)胞直接結(jié)合或者通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)發(fā)揮細(xì)胞殺傷功能；CD56briCD16+/-NK細(xì)胞占外周血NK細(xì)胞的2～10%，主要通過分泌IFN-γ、TNF、IL-2等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能；CD56-CD16+NK細(xì)胞的比例不足10%，是一群具有較低殺傷能力的未成熟的NK細(xì)胞[5]。國(guó)內(nèi)外研究表明HIV感染者和發(fā)病者的具有細(xì)胞毒活性的CD56dimCD16+細(xì)胞百分比明顯低于HIV抗體陰性健康對(duì)照，而殺傷功能較弱的CD56-CD16+NK細(xì)胞百分比明顯高于HIV抗體陰性[6～7]。

我國(guó)學(xué)者對(duì)HAART持續(xù)超過1年的HIV/AIDS患者的NK細(xì)胞亞群研究發(fā)現(xiàn)HAART對(duì)NK細(xì)胞亞群構(gòu)成的恢復(fù)有一定作用，特別是發(fā)揮主要功能的CD56dimCD16+細(xì)胞亞群的恢復(fù)[7]。筆者研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過12個(gè)月的治療HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸對(duì)HIV病毒載量被有效抑制至檢測(cè)限下的HIV/AIDS患者的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和HAART+安慰劑的差異有顯著性差異(P<0.05)。根據(jù)隨機(jī)雙盲試驗(yàn)入組時(shí)CD4+T細(xì)胞基線分層統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)入組時(shí)CD4+T細(xì)胞基線<200個(gè)/μL層的HIV/AIDS患者HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸組在12個(gè)月的隨訪過程中NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的增長(zhǎng)趨勢(shì)好于HAART+安慰機(jī)組的。結(jié)果提示HAART聯(lián)合康愛保生濃縮丸可能提高HIV/AIDS患者的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，提高NK細(xì)胞數(shù)量可能是HAART聯(lián)合中藥或中藥治療艾滋病臨床有效的一個(gè)作用靶點(diǎn)，同時(shí)也是HAART持續(xù)治療過程中中藥介入艾滋病治療的一個(gè)切入點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。HAART聯(lián)合中藥或中藥對(duì)NK細(xì)胞的作用需進(jìn)一步通過規(guī)范的隨機(jī)雙盲試驗(yàn)和擴(kuò)大病例數(shù)、延長(zhǎng)觀察時(shí)間進(jìn)一步確定。同時(shí)應(yīng)考察HAART、HAART聯(lián)合中藥或中藥不同治療措施對(duì)NK細(xì)胞的三個(gè)亞群：CD56dimCD16+、CD56briCD16+/-和CD56-CD16+NK細(xì)胞的干預(yù)作用，從而發(fā)現(xiàn)不同治療措施下NK細(xì)胞亞群的變化趨勢(shì)，為發(fā)揮不同治療措施的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

[1]中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部，聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署，世界衛(wèi)生組織2011年中國(guó)艾滋病評(píng)估報(bào)告[EB/OL].http：//www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohjbyfkzj/s3586/201201/53957.htm.

[2]Torre D，Speranza F，Martegani R．Impact of highly active antiretroviral therapy[J]HIV Med，2005，6(2)：66～78.

[3]Wensing A，VijverDvd，Asjo B，et al．Prevalence of transmitted drug resistance in Europe is largely influenced by the presence of non-B sequences：analysis of 1400 patients from 16 countries：the CATCH-Study[J].Anti vir Ther，2003，8(suppl1)：S131．.

[4]Papamiehail M，Perez SA，Gritzapis AD，et al.Natural killer lymphoeytes：biology，development，and function[J].Cancer Immunol Immunother.2004；53(3)：176～186.

[5]Cooper MA，F(xiàn)ehnige TA，Turner SC，et al.Human natural killer cells：a unique innate immunoregulatory role for theCD56 bright subset[J].Blood.2001，97(10)：3146～3151.

[6]Alter G，Teigen N，Davis BT，et al.Sequential deregulation of NK cell subset distribution and function starting in acute HIV-1 infection[J].Blood，2005，106(10)：3366～3369.

[7]陳歡，何磊，張子寧，等.HIV 感染者、發(fā)病者及 HAART 治療者 NK 細(xì)胞亞群變化研究[J].免疫學(xué)雜志，2010，26(7)：557～560.