王紅梅，李小定,*，熊善柏,2，付 娜，胡 芬

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；

2.國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)分中心(武漢)，湖北 武漢 430070)

直接蒸餾/4-氨基安替比林法檢測(cè)淡水魚(yú)體內(nèi)揮發(fā)酚的含量

王紅梅1，李小定1,*，熊善柏1,2，付 娜1，胡 芬1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；

2.國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)分中心(武漢)，湖北 武漢 430070)

確定對(duì)淡水魚(yú)中揮發(fā)酚進(jìn)行提取、檢測(cè)的最優(yōu)條件，并得出一種能準(zhǔn)確檢測(cè)魚(yú)體中揮發(fā)酚含量的可靠方法。采用蒸餾水代替無(wú)酚水，用硬脂酸做消泡劑，采用100g/L NaOH溶液固定魚(yú)樣品中的揮發(fā)酚，用硫酸酸化再用直接蒸餾法提取魚(yú)體中揮發(fā)酚，并用4-氨基安替比林染色法檢測(cè)魚(yú)體中揮發(fā)酚。結(jié)果表明：本方法的線性范圍為0.002～6mg/L，檢出限為0.05mg/kg，回收率為98.4%～107.0%。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法比較，該方法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)節(jié)能，適于推廣。

揮發(fā)酚；淡水魚(yú)；蒸餾；萃??；4-氨基安替比林

揮發(fā)酚是指能與水蒸氣一起蒸出的酚，通常認(rèn)為沸點(diǎn)在230℃以下為揮發(fā)酚(一般為一元酚)，沸點(diǎn)在230℃以上為不揮發(fā)酚。揮發(fā)酚對(duì)環(huán)境和人體的危害極大。當(dāng)水中含揮發(fā)酚0.1～0.2mg/L時(shí)該水中養(yǎng)殖出的魚(yú)肉便有異味，大于5mg/L時(shí)魚(yú)會(huì)中毒死亡。而人體長(zhǎng)期飲用被揮發(fā)酚污染的水后可引起頭痛、出疹、瘙癢、貧血及各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1]。近幾年，國(guó)內(nèi)外關(guān)于揮發(fā)酚污染事件層出不窮(如2009年7月的鹽城市自來(lái)水事件，2009年6月南莊鎮(zhèn)巷心村河涌遭酚類(lèi)污染，2008年佛山市陶瓷酚水事件等)。揮發(fā)酚已成為水體環(huán)境的一個(gè)極其嚴(yán)重的污染物。水中酚類(lèi)主要來(lái)自煉油、煉焦、煤氣洗滌、造紙、合成氨、木材防腐和化工等行業(yè)的廢水及醫(yī)院污水[2]。

近來(lái)研究表明，水產(chǎn)品中過(guò)量的酚能影響水產(chǎn)品血液中的各項(xiàng)酶活性[3]，酚能通過(guò)改變鏈接蛋白位置來(lái)對(duì)人體腸道上皮細(xì)胞的功能產(chǎn)生阻礙作用[4]。另外，還有研究顯示酚能抑制腸道乳酸菌的活性[5]。由此看來(lái)，揮發(fā)酚對(duì)人類(lèi)的危害需引起廣泛重視。因此，建立一種操作簡(jiǎn)便，適于推廣的檢測(cè)魚(yú)體中揮發(fā)酚含量的方法勢(shì)在必行。

目前，采用直接蒸餾法獲得含揮發(fā)酚的水溶液然后用4-氨基安替比鄰法檢測(cè)淡水魚(yú)體中揮發(fā)酚，無(wú)論是在蒸餾還是在萃取、比色過(guò)程中都存在諸多因素影響揮發(fā)酚檢測(cè)的準(zhǔn)確性[6]。本研究中對(duì)采用4-氨基安替比林法檢測(cè)淡水魚(yú)體內(nèi)揮發(fā)酚的過(guò)程中各種可能影響其檢測(cè)準(zhǔn)確性和效率的環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，從而提高魚(yú)體中揮發(fā)酚檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

各種淡水魚(yú)為市購(gòu)，買(mǎi)后即時(shí)檢測(cè)(如需保存則需于－20℃條件下保存不超過(guò)7d)。

苯酚、NaOH等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；500mL全玻璃蒸餾器、500mL碘量瓶、500mL帶刻度梨形分液漏斗和500mL可調(diào)溫電熱套。

1.3 溶液的配制

緩沖液：稱取20g NH4Cl溶于100mL氨水中，pH 10.7、4℃冷藏；2% 4-氨基安替比林溶液：稱取2g 4-氨基安替比林(C11H13N3O)溶于水中，稀釋至100mL，4℃冷藏，可使用1周；8%鐵氰化鉀溶液：稱取8g鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])溶于水中，稀釋至100mL，4℃冷藏，可使用1周；高質(zhì)量濃度苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[7]：迅速稱取1.0 00 0 g無(wú)色重蒸苯酚溶于蒸餾水中，定容至500mL，配制成2.00g/L高質(zhì)量濃度苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4℃避光保存至少可以穩(wěn)定1個(gè)月；苯酚中間液：吸取5.0 0 m L上述苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用蒸餾水定容至1000mL，配制成10mg/L苯酚中間液，現(xiàn)用現(xiàn)配；苯酚標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取10.00mL上述苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用蒸餾水定容至100mL，配成1μg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液，2h內(nèi)使用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程制作

分別吸取1.00μg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00、15.00mL置于預(yù)先盛有100mL蒸餾水的500mL分液漏斗中，然后再加水至總體積為250mL，混勻。向各分液漏斗中加入2.0mL緩沖溶液，混勻，加入2mL 2g/100mL 4-氨基安替比林溶液，混勻，再加入1.5mL 8g/100mL鐵氰化鉀溶液，使之充分混合，然后靜置10min，加入10mL三氯甲烷，劇烈振搖2min(邊振邊放氣)，靜置，待明顯分層后，用濾紙擦干分液漏斗頸部?jī)?nèi)的水珠，然后用一小團(tuán)濾紙塞進(jìn)分液漏斗的頸部，最后把氯仿層通過(guò)分液漏斗頸部的濾紙團(tuán)過(guò)濾放入比色皿中。在460nm波長(zhǎng)處，用1cm比色皿比色。

1.5 樣品前處理

將從市場(chǎng)上買(mǎi)的魚(yú)去鱗去皮后取魚(yú)背肌肉，然后用絞肉機(jī)將魚(yú)背肌肉絞碎，于－20℃保存待測(cè)。

1.6 樣品蒸餾

稱取絞碎后的魚(yú)肌肉樣品10g左右于500mL燒杯中，加入75mL 100g/L NaOH溶液，劇烈攪拌10min，滴入3～5滴甲基橙指示劑，然后加入9.2mol/L硫酸至溶液呈橙紅色(即pH＜4)，加入100g/L硫酸銅溶液5mL，再加入一小匙硬脂酸，加蒸餾水至300mL，攪拌混勻。將燒杯內(nèi)樣品液移入500mL蒸餾燒瓶中，用溫控電熱套小火加熱，同時(shí)在冷凝管端下放入一個(gè)250mL錐形瓶收集蒸餾液，收集餾出液240mL左右時(shí)停止加熱，并用蒸餾水把冷凝管中殘留的蒸餾液洗入錐形瓶直至蒸餾液達(dá)到250mL。一般蒸餾液中會(huì)含有懸浮物，過(guò)濾去除。蒸餾完畢后，檢查蒸餾殘雜液是否呈酸性，如不呈酸性則重新蒸餾并加大酸的加入量。

1.7 樣品蒸餾液的萃取和比色

將上述餾出液移入500mL帶刻度梨形分液漏斗中，然后操作方法與1.3節(jié)相同。根據(jù)魚(yú)樣品所測(cè)得的吸光度(A)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)的揮發(fā)酚含量(x)，從而計(jì)算樣品中揮發(fā)酚的含量。

式中：A0為不加魚(yú)肉樣品蒸餾、比色所測(cè)得的吸光度即樣品空白值；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；G為魚(yú)肉樣品質(zhì)量/g。

1.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性和靈敏度

本實(shí)驗(yàn)方法在0.002～6mg/L范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=0.0196x－0.0008，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995；靈敏度即校準(zhǔn)曲線斜率k為0.0196。

2.2 檢出限

進(jìn)行11次空白實(shí)驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算得批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差為0.005，該方法的檢測(cè)限為0.05mg/kg。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

表1 揮發(fā)酚檢測(cè)回收率結(jié)果Table 1 Recovery rates for phenols in fish meat with spiked standard

稱取10g左右樣品放入500mL燒杯中，向燒杯中加入不同量的揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)使用液(1.00μg/mL)，操作同1.7節(jié)和1.8節(jié)，得到回收率如表1所示。

在10g魚(yú)樣中加入1μg揮發(fā)酚標(biāo)樣，揮發(fā)酚檢測(cè)回收率在102.0%～107.0%之間；加入揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)液為15μg時(shí)，揮發(fā)酚檢測(cè)回收率在98.4%～99.2%之間。由此說(shuō)明，采用此方法測(cè)魚(yú)樣中揮發(fā)酚準(zhǔn)確性較好。

2.4 樣品蒸餾的條件優(yōu)化

2.4.1 實(shí)驗(yàn)用水

實(shí)驗(yàn)分別采用無(wú)酚水(無(wú)酚水的制備：實(shí)驗(yàn)室蒸餾水中加入NaOH溶液使pH≥11(呈強(qiáng)堿性)，并滴加高錳酸鉀溶液至水呈紫紅色，再移入全玻璃蒸餾器中加熱蒸餾，收集蒸餾液儲(chǔ)存于玻璃容器中)和蒸餾水進(jìn)行空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，用蒸餾水和無(wú)酚水進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)的吸光度差別不大，但制備無(wú)酚水過(guò)程繁瑣，因此在本實(shí)驗(yàn)中完全可以用蒸餾水代替無(wú)酚水。

表2 蒸餾水和無(wú)酚水空白實(shí)驗(yàn)對(duì)比Table 2 Comparison of distilled water and water without phenol

2.4.2 蒸餾裝置的選擇

戰(zhàn)培榮等[8]和Bartak[9]采用水蒸氣蒸餾裝置研究魚(yú)體中揮發(fā)酚的檢測(cè)方法。水蒸氣蒸餾法與本研究所采用的直接蒸餾法蒸餾耗時(shí)都為90min左右，但水蒸氣蒸餾裝置連接較復(fù)雜，需兩個(gè)加熱裝置，同時(shí)加熱耗能大，故本實(shí)驗(yàn)用直接蒸餾代之。本實(shí)驗(yàn)采用直接蒸餾法提取魚(yú)體中的揮發(fā)酚，能得到較高的回收率和較低的檢出限。

2.4.3 防暴沸和消泡條件的選擇

在樣品蒸餾過(guò)程中若不采取任何防暴沸和消泡措施，在蒸餾后期會(huì)隨著溫度升高而產(chǎn)生大量氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。因此，本實(shí)驗(yàn)在蒸餾之前向樣品液中加入一小匙硬脂酸來(lái)做消泡劑。馬運(yùn)宏等[10]用添加硬脂酸和沒(méi)添加硬脂酸的樣品在同等條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示添加硬脂酸后對(duì)實(shí)驗(yàn)并無(wú)顯著影響。另外，本實(shí)驗(yàn)中硬脂酸的加入量只需0.5g，即每次一小匙，硬脂酸加過(guò)多易堵塞冷凝管。添加硬脂酸后的樣品在蒸餾過(guò)程中不會(huì)發(fā)生爆沸現(xiàn)象，因此無(wú)需添加玻璃珠或沸石來(lái)防爆沸。

2.4.4 NaOH質(zhì)量濃度的選擇

在對(duì)樣品前處理時(shí)要用一定質(zhì)量濃度的NaOH，此處NaOH有兩方面的作用。一是作為強(qiáng)堿來(lái)破壞魚(yú)的細(xì)胞組織，從而讓揮發(fā)酚更充分地進(jìn)入溶液中；另外是NaOH能起到固定揮發(fā)酚的作用。羅若榮等[11]采用10g/L NaOH來(lái)浸泡魚(yú)肉樣品過(guò)夜，用這種方法雖然方便但是蒸餾過(guò)程開(kāi)始后一段時(shí)間會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，影響實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行(即使加了消泡劑(硬脂酸)還會(huì)有大量氣泡生成)?？赡苁怯捎贜aOH質(zhì)量濃度太低，不能完全破壞魚(yú)肉組織，致使蒸餾時(shí)產(chǎn)生大量氣泡。所以本實(shí)驗(yàn)采用向魚(yú)肉樣品中加入100g/L NaOH 75mL然后劇烈攪拌10min，這樣既可以讓魚(yú)肉細(xì)胞組織中的酚充分溶出，又可以防止蒸餾過(guò)程中過(guò)量氣泡的產(chǎn)生。

2.5 實(shí)際樣品分析

抽樣選擇7種不同魚(yú)類(lèi)，各取樣10g左右按本方法檢測(cè)其中揮發(fā)酚含量，結(jié)果如表3所示。

由檢測(cè)結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的水產(chǎn)品已經(jīng)受到揮發(fā)酚的污染。其中翹嘴紅鮊體內(nèi)揮發(fā)酚的含量已經(jīng)超出了中國(guó)漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的值(≤0.2mg/kg)?？赡苁怯捎谝话懵N嘴紅鮊不是人工飼養(yǎng)，而是由湖泊中打撈，所以揮發(fā)酚含量較高。另外從檢測(cè)結(jié)果可以看出青魚(yú)、鯉魚(yú)等體內(nèi)揮發(fā)酚含量較鯽魚(yú)、武昌魚(yú)高，這很可能是因?yàn)榍圄~(yú)、鯉魚(yú)等生活在水體的中下層(揮發(fā)酚在水體中呈垂直型遞增，下層水體含揮發(fā)酚量高于上層水體)，而且它們的飼養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致?lián)]發(fā)酚在體內(nèi)蓄積得比鯽魚(yú)等多。由此可以看出，樣品魚(yú)中除翹嘴紅鮊體內(nèi)含揮發(fā)酚超標(biāo)外，其他魚(yú)雖然沒(méi)有超標(biāo)，但是揮發(fā)酚含量也不少。

3 結(jié) 論

3.1 在蒸餾過(guò)程過(guò)用蒸餾水代替無(wú)酚水效果良好；用硬脂酸做消泡劑有效地消除了直接蒸餾時(shí)氣泡難以控制的缺點(diǎn)；而采用較高質(zhì)量濃度的NaOH不僅可以幫助魚(yú)肌肉中的酚更好地溶入水中，而且能起到固定酚的作用。另外，在萃取過(guò)程中一定要注意鐵氰化鉀溶液的加入量，不得小于1.5mL，但也不得大于1.8mL[12]。也要保證4-氨基安替比林的純度以及防止其因光照而分解，對(duì)于4-氨基安替比林，可以采用苯或氯仿對(duì)其進(jìn)行純化[13]。

表3 實(shí)際樣品分析結(jié)果Table 3 Analylical results of actual samples

3.2 采用直接蒸餾4-氨基安替比林法檢測(cè)魚(yú)體中揮發(fā)酚的含量具有良好的線性關(guān)系、回收率和檢出限，而且操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度較水蒸汽蒸餾法快，適于推廣。但是為了進(jìn)一步提高揮發(fā)酚檢測(cè)的準(zhǔn)確性，還可以在探索一種蒸餾過(guò)程中有助揮發(fā)酚跟其他一些難揮發(fā)組分的分離方法，以達(dá)到使蒸餾液雜質(zhì)進(jìn)一步減少，最后達(dá)到減少因蒸餾而引起誤差的目的[14-15]。

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Determination of Volatile Phenols in Freshwater Fish by Direct Distillation-4-Anminoantipyrine (4-AAP) Method

WANG Hong-mei1，LI Xiao-ding1,*，XIONG Shan-bai1,2，F(xiàn)U Na1，HU Fen1
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. National Professional Sub-centers of Research and Development of Bulk Freshwater Fish Processing Technology , Wuhan 430070, China)

In order to obtain a convenient method for the determination of volatile phenols in freshwater fish, the optimal extraction and determination conditions were explored in this paper. Water without phenols was replaced by distilled water. For the elimination of foam, stearic acid was used. The fixation of phenols in fish was achieved by adding NaOH at a concentration of 100 g/L. Acidification with sulfuric acid followed by direct distillation was used for sample extraction of volatile phenols from fish. The measurement of volatile phenols was performed based on 4-anminoantipyrine (4-AAP) staining method. Results indicated that the linear range, detection limit, recovery rate of this method were 0.002－6 mg/L, 0.05 mg/kg, and 98.4%－107.0%, respectively. Compared with traditional methods, direct distillation is a convenient, time-saving and energy-saving method, which is suitable for extensive applications.

volatile；freshwater fish；distillation；extraction；4-anminoantipyrine

R155.55

A

1002-6630(2011)04-0196-04

2010-03-20

王紅梅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：hongfally001@163.com

*通信作者：李小定(1968—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：lixd@mail.hzau.edu.cn