薛曉晶，李 玲，金 涌，李 禮，王 芳，任香夫，田世民*

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

杯碟法檢測(cè)乳中的β-內(nèi)酰胺酶

薛曉晶，李 玲，金 涌，李 禮，王 芳，任香夫，田世民*

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

采用微生物杯碟法對(duì)乳中β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)?；谇嗝顾匾种铺冱S微球菌(Micrococcus luteus)生長(zhǎng)并產(chǎn)生抑菌圈，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的特點(diǎn)，通過(guò)比較含青霉素樣品中加入和未加入舒巴坦所產(chǎn)生的抑菌圈直徑差異，間接判斷樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。結(jié)果表明：青霉素G的最佳使用質(zhì)量濃度為0.5μg/mL，β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)限因生產(chǎn)廠家隨標(biāo)注單位不同而不一致，舒巴坦的最佳使用質(zhì)量濃度為50μg/mL；在此基礎(chǔ)上確立杯碟法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的優(yōu)化方案：設(shè)立陰陽(yáng)性樣品對(duì)照組；并對(duì)同一樣品進(jìn)行4個(gè)不同添加處理：青霉素G處理，青霉素G、舒巴坦處理，青霉素G、β-內(nèi)酰胺酶處理，青霉素G、β-內(nèi)酰胺酶、舒巴坦處理，通過(guò)比較4個(gè)不同處理產(chǎn)生的抑菌圈直徑差異，并同時(shí)參照陰陽(yáng)性樣品對(duì)照組結(jié)果，判定樣品中是否存在β-內(nèi)酰胺酶。

β-內(nèi)酰胺酶；杯碟法；青霉素G；舒巴坦；乳

β-內(nèi)酰胺酶[1-3]是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N(xiāo)-?；苌锓肿又笑?內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵的滅活酶，即可選擇性分解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。近些年，部分不法生產(chǎn)者將其作為“生鮮牛乳抗生素分解劑”使用，用于分解牛乳中殘留的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，使牛乳達(dá)到乳品檢驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)[4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的食用安全性還未得到證實(shí)，但是，經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶分解后的抗生素分解產(chǎn)物可能對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅[5]，如β-內(nèi)酰胺酶可使青霉素四元環(huán)開(kāi)環(huán)，喪失抑菌活性，其分解產(chǎn)物青霉噻唑酸是引起人體青霉素過(guò)敏的主要物質(zhì)之一[6-8]。衛(wèi)生部于2009年3月6日和23日相繼發(fā)布了關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專(zhuān)項(xiàng)整治近期工作重點(diǎn)及要求》的通知(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)〔2009〕21號(hào))[9]和關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專(zhuān)項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案》的通知(食品整治辦〔2009〕29號(hào))[10]，明確指出“添加β-內(nèi)酰胺酶(解抗劑)等非食品用物質(zhì)屬違法行為”。

國(guó)內(nèi)記載或報(bào)道的有關(guān)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法[11-12]有頭孢硝基噻吩顯色法、酸度法、碘量法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和杯碟法。碘量法的檢出限較高，假陰性率高；高效液相色譜法前處理復(fù)雜，背景噪聲較大，假陽(yáng)性率高；酶聯(lián)免疫法易受乳品中其他蛋白干擾等；杯碟法即微生物培養(yǎng)法被認(rèn)為是可靠和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[5-7]。杯碟法的原理是基于青霉素抑制藤黃微球菌(Micrococcus luteus)生長(zhǎng)并產(chǎn)生抑菌圈的基礎(chǔ)上，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的特點(diǎn)，通過(guò)比較含青霉素樣品中加入和未加入舒巴坦所產(chǎn)生的抑菌圈直徑差異，間接判斷樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。此法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判定簡(jiǎn)單，基本可以滿足乳液及乳液制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)需要。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，所用酶活性單位不一致。中國(guó)藥檢所和TCI公司β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品單位均為“U”。前者對(duì)酶單位“U”未給出定義，后者給出的“1 U”定義為，在30℃、pH7.0時(shí)，每小時(shí)分解1IU青霉素為一個(gè)酶活性單位。Sigma公司β-內(nèi)酰胺酶所用單位為國(guó)際單位“IU”，即在25℃、pH7.0時(shí)，每分鐘水解1.0μmol青霉素的酶活性。β-內(nèi)酰胺酶酶活性單位的不統(tǒng)一，將會(huì)影響該酶檢測(cè)的可比性。鑒于以上原因，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)幾種不同品牌的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，確定其在杯碟法中的檢測(cè)限是否一致。

在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有的杯碟法中涉及的青霉素G、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)限等實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，以提高方法的可操作性和檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，為我國(guó)制定相應(yīng)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤黃微球菌[Micrococcus luteus CMCC(B) 28001] 國(guó)家醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心。

腦心浸液、抗生素鑒定培養(yǎng)基2號(hào)(pH6.5～6.6)、舒巴坦 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；青霉素G Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；β-內(nèi)酰胺酶 東京化學(xué)工業(yè)(TCI)公司、美國(guó)Sigma公司、中國(guó)藥品生物制品檢定所(中國(guó)藥檢所)；脫脂奶粉 美國(guó)BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KB240培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司；WNB21L水浴鍋德國(guó)Memmert公司；牛津杯(外徑8mm)；培養(yǎng)皿(90mm)。

1.3 方法

1.3.1 菌平板的制備

將藤黃微球菌單菌落接種于滅菌后的腦心浸液培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18～22h，使菌濃度達(dá)到1×108CFU/mL。將此菌液按1:20(V/V)接種于50～55℃溫水浴的已滅菌抗生素鑒定培養(yǎng)基2號(hào)(pH6.5～6.6)中，充分混勻后用含菌培養(yǎng)基倒平板，約15mL/皿。待培養(yǎng)基凝固后，每培養(yǎng)皿上均勻放置4個(gè)牛津杯。

1.3.2 青霉素G最適使用質(zhì)量濃度的選擇

用10g/100mL脫脂奶液配制不同質(zhì)量濃度的青霉素G溶液，其質(zhì)量濃度為1.00、0.50、0.25μg/mL?；靹蚝笥?.22μm濾膜過(guò)濾，分別加入放置于菌平板上的牛津杯中(200μL/杯)，同時(shí)設(shè)不含青霉素G的脫脂奶液為陰性對(duì)照，每組重復(fù)3皿。36℃培養(yǎng)18～22h。選擇抑菌圈直徑大小約為25～30mm的試樣組，其青霉素G質(zhì)量濃度為實(shí)驗(yàn)最適使用質(zhì)量濃度。

1.3.3 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素G抑菌效果的影響及檢測(cè)限的確定

用10g/100mL的脫脂奶液配制不同酶用量的β-內(nèi)酰胺酶/青霉素G混合溶液。β-內(nèi)酰胺酶用量分別為：TCI組：5.00、2.50、1.00、0.50、0.25U/mL；Sigma組：5、1、0.5、0.1IU/L；中國(guó)藥檢所組：16、8、4、2、1U/mL。青霉素G所使用的質(zhì)量濃度為選擇后的最適使用質(zhì)量濃度。混勻后，分別加入放置于抗生素鑒定培養(yǎng)基上的牛津杯中(200μL/杯)，每組重復(fù)3皿，36℃培養(yǎng)18～22h。觀察抑菌圈直徑大小與青霉素最適濃度對(duì)照組的差異。

1.3.4 舒巴坦最適使用濃度的選擇

用10g/100mL脫脂奶液配制不同質(zhì)量濃度的舒巴坦-β-內(nèi)酰胺酶-青霉素G混合溶液。舒巴坦質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25μg/mL，β-內(nèi)酰胺酶為檢測(cè)限的不同倍數(shù)濃度，青霉素G為最適使用質(zhì)量濃度?；靹蚝蠓謩e加入放置于抗生素鑒定培養(yǎng)基上的牛津杯中(200 μL/杯)，每組重復(fù)3皿。同上培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 青霉素G最適使用質(zhì)量濃度的選擇

表1 不同質(zhì)量濃度青霉素脫脂奶溶液的抑菌圈直徑Table 1 Diameters of inhibition zone produced under different concentrations of penicillin G

按1.3.2節(jié)方法得到不同質(zhì)量濃度青霉素G抑菌圈直徑大小見(jiàn)表1。如表1所示，0.5μg/mL青霉素G產(chǎn)生的抑菌圈約為25～26mm，確定為本實(shí)驗(yàn)研究的適用質(zhì)量濃度。

2.2 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素G抑菌效果的影響及檢測(cè)限的確定

按1.3.3節(jié)方法得到不同公司的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素G抑菌效果(抑菌圈直徑)的影響及其檢測(cè)限見(jiàn)表2。

表2 含0.5μg/mL青霉素的不同β-內(nèi)酰胺酶用量溶液的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zone under different concentrations of β-lactamase and 0.5μg/mL penicillin

如表2所示，β-內(nèi)酰胺酶Sigma組中0.5IU/L組(抑菌圈直徑平均值為19.7mm)及更高用量組、TCI 組中0.5U/mL組(抑菌圈直徑平均值為23.3mm)及更高用量組、中國(guó)藥檢所組中2U/mL組(抑菌圈直徑平均值為20.2mm)及更高用量組，在含有0.5μg/mL青霉素G的脫脂奶溶液中所產(chǎn)生的抑菌圈與青霉素G對(duì)照組(抑菌圈直徑平均值為26.8mm)比較，直徑差異在3.0mm以上。參照衛(wèi)生部的判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，當(dāng)抑菌圈直徑差異不小于3.0mm時(shí)即為“有顯著差異”。以此判斷上述3個(gè)濃度可分別確定為該廠家β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)低限。

2.3 舒巴坦最適使用質(zhì)量濃度的選擇

按1.3.4節(jié)方法，以Sigma組的β-內(nèi)酰胺酶實(shí)驗(yàn)組為例，得到不同質(zhì)量濃度的舒巴坦/β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素G作用所產(chǎn)生的抑菌圈大小見(jiàn)表3。計(jì)算各組抑菌圈與未添加舒巴坦對(duì)照組的直徑差異見(jiàn)表4。

結(jié)果表明，25μg/mL舒巴坦-10.0IU/L β-內(nèi)酰胺酶實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑為10.5mm，未添加舒巴坦-10.0IU/L β-內(nèi)酰胺酶對(duì)照組未產(chǎn)生抑菌圈，按牛津杯直徑計(jì)算為8.0mm，兩組抑菌圈差異為2.5mm；50μg/mL舒巴坦-10.0IU/L β-內(nèi)酰胺酶實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑為21.5mm，與對(duì)照組差異為13.5mm。以衛(wèi)生部方法標(biāo)準(zhǔn)判定，25μg/mL舒巴坦對(duì)10.0IU/L β-內(nèi)酰胺酶(檢測(cè)低限乘以20倍)抑制作用不明顯；50μg/mL舒巴坦可以有效抑制Sigma組β-內(nèi)酰胺酶10.0IU/L對(duì)0.5μg/mL青霉素G的分解作用。相同方法進(jìn)行另外兩個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果50μg/mL舒巴坦可以有效抑制中國(guó)藥檢所組β-內(nèi)酰胺酶40U/mL、TCI組β-內(nèi)酰胺酶40U/mL的分解作用?？偨Y(jié)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇舒巴坦的最適使用質(zhì)量濃度為50μg/mL。

表3 含0.5μg/mL青霉素G、不同用量β-內(nèi)酰胺酶(Sigma組)和舒巴坦脫脂奶溶液的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone under different concentrations of sulbactam,β-lactamase (Sigma) and 0.5μg/mL penicillin G mm

表4 各組所產(chǎn)生抑菌圈直徑與未添加舒巴坦對(duì)照組抑菌圈直徑的差異Table 4 Difference in the diameter of inhibition zone between the presence of sulbactam at various concentrations and its absence mm

2.4 乳樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方案及結(jié)果判定

在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，制定乳樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方案。選用青霉素G母液質(zhì)量濃度100μg/mL、舒巴坦母液質(zhì)量濃度2mg/mL、Sigma公司的β-內(nèi)酰胺酶母液酶用量0.02IU/mL。將待檢樣品充分混勻，調(diào)pH6.0～6.5。分別取1mL待檢樣品于4個(gè)1.5mL離心管中，標(biāo)記A、B、C、D，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，共12管。同時(shí)，每次檢驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照為添加有Sig ma公司的β-內(nèi)酰胺酶濃度為0.5IU/L(檢測(cè)限)的10g/100mL脫脂奶液。陰性對(duì)照為10g/100mL脫脂奶液。制備操作同待檢樣品。

按照下列順序分別將青霉素G母液、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品母溶液、舒巴坦母液加入到樣品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照中：A(青霉素G 5μL)；B(青霉素G 5μL、舒巴坦25μL)；C(青霉素G 5μL、β-內(nèi)酰胺酶25μL)；D(青霉素G 5μL、β-內(nèi)酰胺酶25μL、舒巴坦25μL)。此時(shí)相應(yīng)樣品中青霉素G質(zhì)量濃度為5μg/mL、舒巴坦質(zhì)量濃度為50μg/mL、Sigma公司β-內(nèi)酰胺酶用量為0.5IU/L?；靹蚝?，將上述A～D試樣各200μL加入放置于檢驗(yàn)用平板的4個(gè)牛津杯中，(36±1)℃培養(yǎng)18～22h后，測(cè)量其抑菌圈直徑。每個(gè)樣品，取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照組的結(jié)果應(yīng)為：A、B、D產(chǎn)生抑菌圈，且A、B抑菌圈直徑差異小于3mm，重復(fù)性良好；C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異大于等于3mm，重復(fù)性良好。陽(yáng)性添加對(duì)照組的結(jié)果應(yīng)為：B、D產(chǎn)生抑菌圈，且A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異大于等于3mm，重復(fù)性良好；C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異大于等于3mm，重復(fù)性良好。如為以上結(jié)果，則系統(tǒng)成立，檢測(cè)限(靈敏度)為0.0005IU/mL。

樣品組實(shí)際判定結(jié)果為：①B、D產(chǎn)生抑菌圈，且C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，抑菌圈直徑差異大于等于3mm，重復(fù)性良好時(shí)，A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異大于等于3mm，重復(fù)性良好，則判定該樣品檢出β-內(nèi)酰胺酶，報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；若A、B抑菌圈差異小于3mm，重復(fù)性良好，則判定該樣品未檢出β-內(nèi)酰胺酶，報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)結(jié)果為陰性。②當(dāng)樣品中A不產(chǎn)生抑菌圈且B產(chǎn)生的抑菌圈小于11mm或A、B均不產(chǎn)生抑菌圈，說(shuō)明可能樣品中β-內(nèi)酰胺酶酶用量過(guò)高，舒巴坦無(wú)法有效抑制酶的活性。此時(shí)應(yīng)將樣品稀釋1 0倍，再進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)室用此方法檢測(cè)市場(chǎng)送檢48例樣品，檢出陽(yáng)性樣品14例，檢出率為29.17%。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，不同廠家生產(chǎn)的β-內(nèi)酰胺酶其檢測(cè)限各不相同——Sigma組為0.5IU/L、TCI組為0.5U/mL、中國(guó)藥檢所組為2U/mL，說(shuō)明酶的單位活性存在很大差異。這一現(xiàn)象與各個(gè)廠家所使用的酶活性單位及單位定義不一致有很大關(guān)系。制定β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，首先必須確定酶的檢測(cè)限。在此酶活性單位的統(tǒng)一是一個(gè)重要問(wèn)題。確定不同品牌的β-內(nèi)酰胺酶活性單位的特定比例關(guān)系、單位換算公式以及酶在最適條件下的單位活性與實(shí)驗(yàn)條件下的單位活性之間的差異，是今后研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

經(jīng)觀察還發(fā)現(xiàn)，中國(guó)藥檢所組和TCI組的β-內(nèi)酰胺酶均為液體，開(kāi)封后酶活性降低較快，不易保存。Sigma公司的酶為干粉狀，易于保存，溶解后在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)活性穩(wěn)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議在酶單位未統(tǒng)一之前，選用以國(guó)際單位IU為標(biāo)準(zhǔn)單位、以干粉狀態(tài)保存的Sigma公司的β-內(nèi)酰胺酶作為實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性。

在舒巴坦質(zhì)量濃度的選擇上，衛(wèi)生部方法所采用舒巴坦質(zhì)量濃度為25μg/mL，在本實(shí)驗(yàn)中，此質(zhì)量濃度對(duì)20倍于檢測(cè)限濃度的β-內(nèi)酰胺酶抑制效果不顯著；50μg/mL舒巴坦對(duì)此濃度β-內(nèi)酰胺酶的抑制效果非常顯著。本實(shí)驗(yàn)使用的舒巴坦上限質(zhì)量濃度為200μg/mL，50μg/mL舒巴坦遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于上限質(zhì)量濃度，此質(zhì)量濃度本身不會(huì)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差，且對(duì)β-內(nèi)酰胺酶酶用量檢測(cè)上限更高。因此建議將舒巴坦質(zhì)量濃度調(diào)整為50μg/mL用于實(shí)際檢測(cè)。

在藤黃微球菌培養(yǎng)中，崔生輝等[5]實(shí)驗(yàn)中所使用的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅰ(pH6.5±0.1)和Ⅳ(pH6.1±0.1)培養(yǎng)基，菌生長(zhǎng)狀態(tài)不理想。本實(shí)驗(yàn)改用抗生素鑒定培養(yǎng)2號(hào)(pH6.5～6.6)，菌生長(zhǎng)良好。在檢測(cè)平板的制備中，放棄底層基礎(chǔ)培養(yǎng)基的鋪設(shè)，直接鋪倒含菌培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，避免了鋪設(shè)兩層培養(yǎng)基可能帶來(lái)的鋪板過(guò)厚、不均勻等問(wèn)題，同時(shí)簡(jiǎn)化操作程序，提高效率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，兩種鋪板方法所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

在檢測(cè)方案的設(shè)計(jì)方面，以衛(wèi)生部方法為基礎(chǔ)進(jìn)行了兩點(diǎn)改進(jìn)：一是添加了陽(yáng)性對(duì)照組，該組樣品添加有檢測(cè)限濃度的β-內(nèi)酰胺酶，以進(jìn)一步確保實(shí)驗(yàn)的有效性和穩(wěn)定性；二是將陰性/陽(yáng)性對(duì)照組的溶液基質(zhì)由水改為10g/100mL陰性脫脂奶液，使其與待檢測(cè)樣品的基質(zhì)更為接近，保證了實(shí)驗(yàn)條件的一致性。

總而言之，β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法研究還處于初期階段，微生物杯碟法作為一種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法在檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)和精度上還存在著不足。此法只能滿足定性檢測(cè)的需要，在定量檢測(cè)研究方面還存著很大的空白。而樣品中存在的β-內(nèi)酰胺酶除了人為添加外，還可能來(lái)源于微生物[5]，目前已知的各種檢測(cè)方法還無(wú)法對(duì)此兩種來(lái)源的β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行區(qū)分，這可能致使檢測(cè)中假陽(yáng)性率偏高。為進(jìn)一步完善β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，對(duì)酶的穩(wěn)定性、添加限量、定量檢測(cè)等多方面進(jìn)行研究是下一步的研究?jī)?nèi)容。

[1] 刑旺興. β-內(nèi)酰胺酶的基本特性及其檢驗(yàn)方法[J]. 國(guó)外醫(yī)藥: 抗生素分冊(cè), 1995, 16(6): 409-414.

[2] KORYCKA-DAHL M, RICHARDSON T, BRADLEY R L Jr. Use of microbial beta-lactamase to destroy penicillin added to milk[J]. J Dairy Sci, 1985, 68(8): 1910-1916.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典: 二部[S]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 附錄84.

[4] 于家豐, 田穎, 周惠強(qiáng). 加強(qiáng)β-內(nèi)酰胺酶監(jiān)管刻不容緩[J]. 經(jīng)營(yíng)管理, 2009(9): 57-58.

[5] 崔生輝, 李景云, 馬越, 等. “生鮮牛乳抗生素分解劑” 的鑒定與檢測(cè)[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2007, 19(2): 113-116.

[6] 夏翠華. 青霉素過(guò)敏反應(yīng)機(jī)理及過(guò)敏試驗(yàn)研究近況[J]. 中華護(hù)理雜志, 1994, 29(11): 682-683.

[7] 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局. 動(dòng)物性食品中青霉素類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)方法: 微生物法[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2004, 38(3): 14-15.

[8] SUTHELAND R. β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與抗生素耐藥性的逆轉(zhuǎn)[J]. 劉小康, 譯. 國(guó)外醫(yī)藥: 抗生素分冊(cè), 1993, 14(4): 259-263.

[9] 衛(wèi)生部. 關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專(zhuān)項(xiàng)整治近期工作重點(diǎn)及要求》的通知(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2009]21號(hào))[EB/OL]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0056/38681.html.

[10] 衛(wèi)生部. 關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專(zhuān)項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案》的通知(食品整治辦[2009]29號(hào))[EB/OL]. http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s3594/200903/39650.htm.

[11] 桂炳東. β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定進(jìn)展及臨床意義[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2002,20: 64-66.

[12] 唐群力. 兩種β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法的應(yīng)用比較[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2008, 5(7): 427-428.

Detection ofβ-Lactamase in Milk Based on Cylinder Plate Method

XUE Xiao-jing，LI Ling，JIN Yong，LI Li，WANG Fang，REN Xiang-fu，TIAN Shi-min*
(Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

Here, we adopted microbiological cylinder plate method to detectβ-lactamase in milk. Since penicillin inhibits the growth of Micrococcus luteus, producing a zone of inhibition, the difference between the diameters of inhibition zone produced by penicillin alone and together with sulbactam, which specifically inhibits the activity of β-lactamase, will indirectly suggest whether or not a sample contains the enzyme. The optimum working concentration of penicillin G determined in this study was 0.5μg/mL. The influence ofβ-lactamase products from different manufacturers with different given units on the antimicrobial activity of penicillin G in liquid skim milk was evaluated, and the results showed that the limits of detection of the developed method for them were different. Addition of sulbactam at 50 μg/mL provided optimum detection of β-lactamase. Based on the above investigations, the optimum protocol for detecting β-lactamase by cylinder plate method in milk was that the presence or not ofβ-lactamase was identified based on differences in the diameter of inhibition zone among additions of penicillin G alone or in combination with sulbactam or/and β-lactamase to one sample together with the results from constructed positive and negative controls.

β-lactamase；cylinder plate method；penicillin G；sulbactam；milk

TS252.7

A

1002-6630(2011)04-0216-04

2010-03-26

薛曉晶(1981—)，女，實(shí)習(xí)研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩吧餀z測(cè)。E-mail：xxjing528@163.com

*通信作者：田世民(1964—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩吧餀z測(cè)。E-mail：shimintian@yahoo.com.cn