廖春龍，印遇龍,3，阮 征,*，文紅艷

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031；3.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125)

β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖工藝優(yōu)化

廖春龍1,2，印遇龍1,2,3，阮 征1,2,*，文紅艷1,2

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031；3.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125)

目的：確定β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖的最佳工藝條件。方法：以蔗糖和乳糖為底物，利用β-呋喃果糖苷酶粗酶液合成低聚乳果糖，通過單因素和Box-Behnken試驗，對酶法合成工藝進行響應面分析，得到酶法合成低聚乳果糖的最佳工藝參數。結果：最佳工藝條件為反應時間22.77h、pH7.0、反應溫度35.0℃、底物質量濃度20.0g/100mL、底物與酶的體積比1:1，低聚乳果糖含量為22.70%。結論：Box-Behnken結合響應面優(yōu)化果糖苷酶法合成低聚乳果糖工藝，模型可靠，方法可行。

低聚乳果糖；β-呋喃果糖苷酶；Box-Behnken試驗設計；響應面

低聚乳果糖(lactosucrose, LS)，化學名為O-β-D-galactopyranosyl-(1 →2)-β-D-fructofuranoside，低聚乳果糖是以蔗糖和乳糖為底物，經節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)產生的β-呋喃果糖苷酶的作用生成的。β-呋喃果糖苷酶是一種胞外酶，由節(jié)桿菌發(fā)酵獲得，它具有水解活力和果糖基轉移活力，能將蔗糖水解成葡萄糖和果糖基，并通過轉移活力將果糖基轉移到乳糖的還原性末端C1原子上，得到低聚乳果糖[1-2]。

目前，低聚乳果糖生理功能的研究主要集中在作用機理、基因代謝調控以及其在醫(yī)用保健方面的價值等方面[3-6]。低聚乳果糖很難被人唾液中的消化酶、胃液及小腸黏膜中的酶消化水解，幾乎不被分解直達大腸，能量值極低，很少被轉化為脂肪，具有降血脂、降低膽固醇等功效。研究發(fā)現[7]每天攝入5g低聚乳果糖，糞便中雙歧桿菌數會有顯著增加。研究表明低聚乳果糖可以改變腸道微生態(tài)環(huán)境，調節(jié)腸道的免疫功能[8]。由于能調節(jié)腸道微生物菌群的關系，低聚乳果糖對治療慢性腸炎有一定效果[9]。低聚乳果糖經過腸道微生物代謝為乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，可使得腸道內的pH值下降，從而抑制了腸道內腐敗微生物和病源微生物的生長[10]?；诘途廴楣堑纳鲜鰩追N生理功能，服用一定量的低聚乳果糖不僅能夠調整腸道菌群，而且可以降低某些疾病發(fā)生的風險性。

圖1 低聚乳果糖的生成反應Fig.1 Reaction mechanism for lactosucrose synthesis

目前，國內的低聚糖生產廠家總的年產能大約為10萬噸左右，其中主要種類為低聚異麥芽糖和低聚果糖，而我國2011年低聚糖產品的年需求量將達20萬噸以上，市場缺口比較大。由于我國低聚糖的種類和產能都與國外存在較大的差距，所以研究開發(fā)新型的低聚糖及實現其工業(yè)化具有重要的意義。低聚乳果糖的產業(yè)化在國內一直未見報道，原因是在生產中酶的活力和糖的純化制約了其在國內的發(fā)展。隨著人們保健意識的日益增強和食品工業(yè)的發(fā)展，各種新型功能性食品添加劑的市場需求越來越大，作為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ牡途廴楣堑男枨笕笨谝矊⒃絹碓酱?，而酶法合成低聚乳果糖是唯一能解決這個問題的方法，因此低聚乳果糖酶法合成技術已成為急待解決的問題。

本實驗擬通過單因素和Box-Behnken試驗設計，對酶法合成工藝進行響應面分析，以期獲得酶法合成低聚乳果糖的最佳工藝參數，為低聚乳果糖的中試和生產提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種(Arthrobacter sp. 10138) 中國普通微生物菌種保藏管理中心；β-呋喃果糖苷酶粗酶液(酶活250U/mL)實驗室自制；低聚乳果糖標準樣 日本WAKO有限公司；乙腈(色譜純) 美國Tedia公司；蔗糖、乳糖均為分析純；二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

SHA-CA水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市榮華儀器有限公司；1200高效液相色譜儀(配有美國Softa Model 300s ELSD檢測器) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

菌種活化后按體積分數2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、pH7.0、110r/min培養(yǎng)24h，裝液量為500mL發(fā)酵瓶裝200mL。培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液以4000r/min離心20min，收集上清液置于－20℃冰柜中放置1d，再取出解凍，使沒有離心干凈的節(jié)桿菌因溶脹作用而失活。經過酶活測定，酶活為250U/mL。一個酶活力單位定義為在pH7.0條件下，將3mL粗酶液和3mL糖液(含20g/100mL蔗糖和乳糖)于37℃反應24h，每分鐘產生10-9mol低聚乳果糖的量。

1.3.2 酶法合成低聚乳果糖

乳糖蔗糖混合液與酶混合，考察底物質量濃度、反應時間、反應pH值、酶用量、反應溫度5因素對低聚乳果糖得率的影響，用單因素試驗得出水平范圍，再用Box-Behnken設計結合響應面分析確定找到最佳酶法合成條件。

1.4 檢測方法

采用HPLC-ELSD法對低聚乳果糖含量進行測定。HPLC色譜條件：色譜柱：Kromasil氨基柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水(75:25)；流速：1mL/min；柱溫：30℃；漂移管溫度：70℃；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器。

2 結果與分析

2.1 低聚乳果糖的成分分析

微生物酶法合成的低聚乳果糖成分比較復雜，主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚乳果糖，低聚乳果糖的液相色譜圖如圖2所示。

圖2 低聚乳果糖的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of lactosucrose synthesized under the catalysis ofβ-fructofuranoside

2.2 底物質量濃度對LS合成的影響

以等質量混合乳糖和蔗糖為底物，取不同質量分數的底物混合液3mL，與3mL粗酶液混合，底物pH7.0，反應溫度37℃，反應時間為16h，混合后底物質量濃度水平選擇10、20、30、40、50、60g/100mL。

由圖3可以看出，底物質量濃度的變化對LS的得率影響不大，理論上增加底物質量濃度可以降低整個體系的水分活度，可以增加酶的轉移活性，但是增加底物質量濃度，底物的黏度也會隨之增加，不利于反應的進行，所以在實際的操作過程中，底物質量濃度選擇20g/100mL是比較符合實驗要求的。

圖3 底物質量濃度對LS合成的影響Fig.3 Effect of total concentration of two sugars in aqueous solution on lactosucrose synthesis

2.3 反應時間對LS合成的影響

乳糖蔗糖混合液3mL與3mL粗酶液混合，底物質量濃度20g/100mL，底物pH7.0，反應溫度37℃，反應時間水平為8、16、24、32、40、4 8h。

圖4 反應時間對LS合成的影響Fig.4 Effect of reaction time on lactosucrose synthesis

當底物質量濃度20g/100mL、反應時間24h，LS最大得率為20.91%，當反應時間繼續(xù)增加時，低聚乳果糖含量反而會降低。LS酶法合成是一個可逆反應，隨著反應時間的增加，水解產物葡萄糖的增加會抑制合成反應的正向進行，LS水解，含量降低。

2.4 底物pH值對LS合成的影響

圖5 pH值對LS合成的影響Fig.5 Effect of pH on lactosucrose synthesis

乳糖蔗糖混合液3mL與3mL粗酶液混合，底物質量濃度20g/100mL，反應時間24h，反應溫度37℃，底物 pH5.7、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

由圖5可得，底物pH7.0時，LS含量為20.51%，說明底物pH7.0時，酶的轉移活力最高，pH值過高或者過低都會影響酶的轉移活力。

2.5 酶用量對LS合成的影響

配制60%混合糖液，取3mL，分別加入0.5、1、2、3、4、5mL粗酶液，然后再加入PBS緩沖液(0.05mol/L、pH7.0)至9mL，確保體系的底物質量濃度20g/100mL，反應時間24h，反應溫度37℃，底物pH7.0，考察酶用量對LS合成的影響。

圖6 酶用量對LS合成的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on lactosucrose synthesis

酶用量過低，LS含量也低，究其原因是因為酶濃度過低，底物與酶的結合不充分，隨著酶用量的增加，LS含量會急劇增加，當酶用量為3mL的時候，LS含量為20.32%，隨著酶用量的繼續(xù)增加，LS的含量反而有所降低，分析其原因可能是因為酶所具有的水解活性水解低聚乳果糖所造成的，所以3mL混合糖液中酶用量為3mL，即混合糖液與酶用量體積比為1:1為最佳。

2.6 反應溫度對LS合成的影響

乳糖蔗糖混合液3mL與3mL粗酶液混合，底物質量濃度20g/100mL，反應時間24h，底物pH7.0，反應溫度水平選擇為27、32、37、42、47℃。

圖7 反應溫度對LS合成的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on lactosucrose synthesis

溫度過低時，則酶的活性低，故合成的LS含量也低，在32～37℃的時候，LS含量比較高，在32℃時，LS含量達到21.77%。隨著溫度的再度增加，酶活降低，LS合成的量急劇下降。

2.7 響應面優(yōu)化LS合成工藝

根據單因素試驗結果，選擇反應時間、底物p H值、反應溫度這3個因素設計試驗，用響應面對合成工藝進行優(yōu)化。

表1 β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Coded values and corresponding actual values of variables in response surface analysis

表2 β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Scheme and experimental results for response surface analysis

利用SAS軟件對試驗結果進行分析，得到LS得率與反應時間、底物pH值、反應溫度的二次多項回歸模型為Y=22.54667－0.14875X1＋0.2575X2＋0.46375X3－1.062083X12－1.34X1X2－1.1575X1X3－2.739583X22－1.98X2X3－2.817083X32，由表3可知，X1X2、X1X3項顯著，、X2X3、項極顯著，其因變量和全體自變量之間的線性關系即回歸方程的相關系數為0.9554，這也表明響應值的變化有95.54%來自有所選變量(反應時間、底物pH值、反應溫度)，平方項極顯著、交互項顯著、模型極顯著，失擬項不顯著，表明該方程對試驗擬合較好，可以用于LS酶法合成的預測。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of the predicative regression model for the content of lactosucrose in reaction product

響應面圖形是響應值對各因素X1、X2、X3所構成的三維空間曲面圖，從這些三維圖可以很直觀的看出各參數和最佳參數之間的相互作用。

圖8 Y=f(X1,X2)的響應面Fig.8 Response surface polt of Y=f(X1,X2)

圖9 Y=f(X1,X3)的響應面Fig.9 Response surface polt of Y=f(X1,X3)

圖10 Y=f(X2,X3)的響應面Fig.10 Response surface polt of Y=f(X2,X3)

通過運行所編寫程序得到最佳工藝參數的臨界值，如表6所示，反應時間22.77h、pH7.03、反應溫度35.48℃，在最佳工藝條件下LS預測值22.59%，由于在實際操作過程中，條件控制達不到如此精確，故取最佳反應時間22.77h、pH7.0、反應溫度35℃，在此條件下的實際值為(22.70±0.2)%(重復3次)，說明該模型可靠。

表4 臨界值Table 4 Critical values of various reaction conditions

3 討論與結論

中心組合(CCD)設計和Box-Behnken設計均可以擬合一個二次完全析因設計的響應面設計，也是目前較為常用的響應面法。作為3水平部分因素設計的Box-Behnken設計是相對于中心組合設計的較優(yōu)選擇。通過B ox-Behnken設計和響應面分析，利用SAS軟件，優(yōu)化低聚乳果糖的酶法合成工藝參數(底物質量濃度、酶用量、反應時間、底物p H值、反應溫度)，最終得到最佳工藝參數為底物質量濃度20g/100mL、底物與酶的體積比1:1、反應時間22.77h、pH7.0、反應溫度35℃，在此條件下酶法合成低聚乳果糖含量為22.7%，取得較理想效果，該實驗對酶法合成低聚乳果糖的工業(yè)化有一定的指導作用。

朱桂蘭等[11]對低聚乳果糖的酶法合成進行研究，反應條件為等體積的粗酶液和糖液(含40%的蔗糖和乳糖)，pH6.5于37℃反應24h，得到低聚乳果糖含量為16.38%。Han等[12]也對該反應進行了研究，得到的最佳工藝參數是23℃、pH7.0、底物質量濃度36g/100mL(蔗糖18%、乳糖18%)，得到的低聚乳果糖含量28.50%，此結果與本實驗的結果相比較高，可能是因為酶有所不同，Han等[12]使用的酶為果聚糖蔗糖酶(levansucrase)。

由于在合成低聚乳果糖的過程中，會存在副反應和逆反應，即β-呋喃果糖苷酶會水解蔗糖產生葡萄糖和水解低聚乳果糖，會抑制合成反應的進行，如果想使反應產生更多的低聚乳果糖，就必須使用一定的手段移除反應過程中產生的葡萄糖，否則很難將低聚乳果糖的含量提高。如利用酵母消耗反應過程中的葡萄糖，利用流化床移除葡萄糖，或者利用雙酶法等方法提高酶催化反應產生的低聚乳果糖含量，再通過過膜、離子交換層析等方法來提高低聚乳果糖的含量[13-16]，而國內這些技術在低聚乳果糖開發(fā)利用上的研究較少，是進一步研究的重點。

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Process Optimization for Beta-fructofuranoside-catalyzed Synthesis of Lactosucrose

LIAO Chun-long1,2，YIN Yu-long1,2,3，RUAN Zheng1,2,*，WEN Hong-yan1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；
2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；
3. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)

Objective: To obtain the optimum process conditions for the synthesis of lactosucrose under the catalysis of βfructofuranoside. Methods: Lactosucrose was prepared from lactose as an acceptor and sucrose as a fructosyl donor by a fructose-transferring enzyme, β-fructofuranoside derived from Arthrobacter sp.10138. The process was optimized by Box-Behnken experimental design followed by response surface analysis. Results: Adding the same volume of β-fructofuranoside solution to a mixture of lactose and sucrose in equal proportion by weight in aqueous solution to catalyze the reaction between the two sugars for 22.77 h at 35.0 ℃ provided optimum synthesis of lactosucrose, and the content of lactosucrose in reaction product was 22.70%. Conclusion: Combined use of Box-Behnken experimental design and response surface methodology has the feasibility to be used as a mathematical approach to optimize the synthesis process for lactosucrose, and the established model is reliable in predicting the content of lactosucrose in reaction product.

lactosucrose；β-fructofuranoside；Box-Behnken experimental design；response surface methodology

TS247

A

1002-6630(2011)04-0102-05

2010-04-15

南昌大學“贛江學者獎勵計劃”項目；中國博士后科學基金資助項目(20080440166)

廖春龍(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為農產品加工與碳水化合物利用。E-mail：lclong0213@126.com

*通信作者：阮征(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為食物營養(yǎng)調控與糖工程。E-mail：ezruan@yahoo.com