徐 飛

(南通精華制藥股份有限公司，江蘇南通226006)

苯巴比妥化學(xué)名為5－乙基－5－苯基－2，4，6(1H，3H，5H)－嘧啶三酮，是我公司生產(chǎn)的一種鎮(zhèn)靜催眠和抗驚厥原料藥，用于焦慮、失眠、癲癇及驚厥.本公司在2007年申報(bào)的歐洲CEP注冊(cè)時(shí)遞交了一個(gè)企業(yè)內(nèi)部的HPLC方法對(duì)苯巴比妥的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制，這種方法使用的是梯度洗脫，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)時(shí)主要考慮對(duì)苯巴比妥的起始原料苯基乙基丙二酸二乙酯及其中的一些雜質(zhì)進(jìn)行控制，今年4月份歐洲EP7.1頒布了苯巴比妥的新檢測(cè)方法，所以對(duì)兩者方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治鰧?duì)比.

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters600泵，486檢測(cè)器，717自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower色譜軟件.

1.2 藥品和試劑 苯巴比妥二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品(本公司制備)，苯巴比妥產(chǎn)品(本公司生產(chǎn))，甲苯比妥工作標(biāo)準(zhǔn)品(泰興森萱)，苯巴比妥雜質(zhì) A、B(從 EDQM購(gòu)買)，甲醇為色譜純(Merk公司)，其余試劑為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CEP規(guī)格方法測(cè)試苯巴比妥的有關(guān)物質(zhì)，方法為:色譜柱Cs/Cm L1(4.0 mm ×250 mm，5 μm，Waters公司)，流動(dòng)相A:乙酸鈉三水化合物pH4.5，流動(dòng)相B:甲醇流速 1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng) 220 nm，進(jìn)樣量 10 μL，梯度洗脫方法見(jiàn)表1.

表1 CEP測(cè)定梯度洗脫方法

EP7.1的方法為:流動(dòng)相為:緩沖溶液 －甲醇 =60∶40，緩沖溶液:將6.6 g乙酸鈉溶于900 mL超純水，加入3 mL冰醋酸，再用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，然后用水稀釋至1 000 mL，流速 1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量20 μL.柱溫為室溫.均是采用外標(biāo)法對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行計(jì)算.

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別制備苯巴比妥自身對(duì)照液、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B濃度為0.005 mg·mL－1的甲醇溶液.

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取苯巴比妥樣品，用甲醇配制成5 mg·mL－1的樣品溶液.

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性比較 按EP7.1的方法在雜質(zhì)A和B的混合溶液譜圖中計(jì)算出A和B之間的分離度為1.97，配制6個(gè)苯巴比妥工作標(biāo)準(zhǔn)品的溶液計(jì)算其重復(fù)性RSD為0.5%，有很好的重復(fù)性.分別采用雜質(zhì)A和B及混合樣，圖譜顯示各峰獨(dú)立清晰且無(wú)任何溶劑的干擾.CEP規(guī)格方法對(duì)雜質(zhì)A和B的分離度不能達(dá)到大于1.5的要求，且因其梯度洗脫，所以整個(gè)基線波動(dòng)變化較大，對(duì)小雜質(zhì)的檢測(cè)有影響.

2.4 檢測(cè)限和定量限的比較 在兩種方法條件下，以信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度確定為檢測(cè)限，信噪比為10∶1時(shí)確定為定量限，分別配制一定低濃度的甲苯比妥和苯巴比妥進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果EP7.1方法對(duì)甲苯比妥的檢測(cè)限是0.005 0%，定量限是0.017%(相對(duì)于測(cè)試樣)，苯巴比妥的檢測(cè)限是0.002 7%，定量限是0.092%(相對(duì)于測(cè)試樣).CEP方法對(duì)甲苯比妥的檢測(cè)限是0.006 1%，定量限是0.021%(相對(duì)于測(cè)試樣).從數(shù)據(jù)可知EP7.1的方法檢測(cè)限和定量限都比CEP方法更好，其檢測(cè)靈敏性更高.

2.5 兩種標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試比較 EP7.1方法主要控制雜質(zhì)A(5－乙基 －2，6－二亞胺基 －5－苯基四氫嘧啶酮)(≤0.15%)和B(5－乙基－6－亞胺基－5－苯基二氫嘧啶二酮)(≤0.15%)，其余未指明雜質(zhì)≤0.10%，總雜質(zhì)≤0.20%;CEP注冊(cè)方法控制巴比妥酸≤0.15%，甲苯比妥≤0.15%，其余未指明雜質(zhì)≤0.10%，總雜質(zhì)≤0.25%.在兩種方法條件下，對(duì)本公司生產(chǎn)的10批進(jìn)行檢測(cè)，EP7.1方法能檢測(cè)出雜質(zhì)B，而CEP方法不能檢出，且對(duì)樣品中主要雜質(zhì)甲苯比妥的檢測(cè)，EP7.1方法能檢測(cè)大于0.01%的效果，對(duì)巴比妥酸也能檢測(cè)，其余未指明雜質(zhì)EP7.1方法能檢測(cè)出4個(gè)，CEP方法只能檢測(cè)出2～3個(gè)，雖然CEP方法是為了控制起始原料的雜質(zhì)，但在成品檢測(cè)結(jié)果中未有起始原料的有關(guān)雜質(zhì)，且一批樣品的分析時(shí)間CEP比EP7.1方法長(zhǎng)20 min.可見(jiàn)，EP7.1方法能更加有效檢測(cè)控制苯巴比妥產(chǎn)品中的雜質(zhì)，是一種更適用可行的檢測(cè)方法.相關(guān)圖譜見(jiàn)圖1～6.

3 討論

通過(guò)對(duì)苯巴比妥兩種HPLC分析方法比較可以看出，EP7.1方法更加靈敏，對(duì)雜質(zhì)的檢查更加有效可行，且每批檢測(cè)時(shí)間也縮短，提高了分析工作效率，本公司現(xiàn)已采用EP7.1方法進(jìn)行日常檢測(cè)，且在歐洲的注冊(cè)也進(jìn)行了分析方法變更申請(qǐng).

圖1 EP7.1方法檢測(cè)雜質(zhì)對(duì)照A和B

圖2 EP7.1方法檢測(cè)本公司注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照

圖3 EP7.1方法檢測(cè)本公司樣品

圖4 CEP注冊(cè)方法檢測(cè)雜質(zhì)對(duì)照A和B

圖5 CEP注冊(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照測(cè)試

圖6 CEP注冊(cè)方法測(cè)試本公司樣品