王晉濤，郭建軍，尉志文，萬東方，王勇，王玉瑾，贠克明

苯巴比妥（phenobarbital）又稱魯米那（luminal），屬于長效巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇及中樞性肌肉松弛作用［1］，已經(jīng)在臨床應(yīng)用多年。由于服用苯巴比妥中毒及大劑量苯巴比妥進(jìn)行自殺報(bào)道的案例較多［2］，成為法醫(yī)工作者非常重視的臨床中毒藥物之一。目前，有關(guān)苯巴比妥的研究雖然有很多報(bào)道［3－6］，但主要集中于藥效學(xué)及藥動(dòng)力學(xué)、作用機(jī)制及機(jī)體內(nèi)苯巴比妥含量的測定［5－9］，有關(guān)苯巴比妥死后分布研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)建立苯巴比妥死后分布動(dòng)物模型，研究苯巴比妥在大鼠體內(nèi)的死后分布規(guī)律，為苯巴比妥中毒死亡案件的檢材采取和結(jié)果分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 TRACE GC＆DSQ 氣相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Finnigan公司；TRACE 2000GC 氣相色譜儀，美國Thermo Finnigan公司。

1.2 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀條件 DB－5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25m×0.25μm），EI源70ev；質(zhì)量范圍50～650，柱溫130 ℃（1min）→10 ℃（1min）→240 ℃（2 min）；離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，載氣：He，1.5mL／min。

1.3 氣相色譜條件 DB－5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫130 ℃（1min）→10 ℃（1min）→240 ℃（2 min）；檢測器：300 ℃，空氣60kPa，氫氣2.3kPa，載氣：N2，1.5mL／min，NPD 檢測器。

1.4 試劑 苯巴比妥對照品購于公安部物證鑒定中心，苯巴比妥片（上海金山制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021610）；10%鹽酸溶液；丙烯巴比妥（內(nèi)標(biāo)液）配制成1.0mg／mL醇儲(chǔ)備液，置冰箱保存；其他試劑均為分析純。

1.5 動(dòng)物模型 雄性Wistar大鼠12只，體重200g±20g，隨機(jī)分為LD50組和2LD50組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前隔夜禁食。經(jīng)胃勻速注入LD50（0.66mg／kg）和2LD50（1.32mg／kg）苯巴比妥。待呼吸和心跳全部消失時(shí)，迅速解剖動(dòng)物，取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦、胃等冷凍保存待檢。

1.6 樣品提取和檢測 取固體檢材1g或血1mL，加蒸餾水1mL，加入內(nèi)標(biāo)液20μL，振蕩，固性檢材超聲細(xì)胞粉碎（JYD－650L智能型）勻漿3min，10%HCl調(diào)pH2～3，振蕩搖勻，加入5mL乙醚，振蕩15min，1 800r／min離心10min，將上清液移入另一干凈且干燥試管中，重復(fù)萃取一次。40 ℃恒溫水浴中揮干，殘?jiān)?0μL無水乙醇定容，取1μL 進(jìn)樣檢測，利用保留時(shí)間結(jié)合特征離子峰（氣－質(zhì)聯(lián)用）定性，內(nèi)標(biāo)法和工作曲線法（氣相色譜）定量［7，8］。

1.7 工作曲線和回收率

1.7.1 工作曲線 取空白大鼠肝臟1g和血液1mL分別加入苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液及丙烯巴比妥溶液，配制成含有苯巴比妥0.5μg／g（μg／mL）、1μg／g、2μg／g、4 μg／g、8μg／g、10μg／g、12μg／g、16μg／g、18μg／g、20 μg／g、24μg／g、32μg／g和丙烯巴比妥20μg／g的系列樣品，按1.6項(xiàng)方法提取并檢測。以苯巴比妥濃度為橫坐標(biāo)（X），苯巴比妥與內(nèi)標(biāo)丙烯巴比妥的峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，所得肝臟線性回歸方程Y＝0.021 2X－0.000 4，r2＝0.994；血液線性回歸方程Y＝43.476X＋0.817，r2＝0.995 5。結(jié)果表明，肝臟和血液中苯巴比妥在0.1μg／g～32μg／g線性關(guān)系良好。

1.7.2 回收率 空白肝中加入苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5μg、16μg、32μg，按1.6方法提取并檢測，工作曲線法計(jì)算檢材中苯巴比妥含量，肝中苯巴比妥的提取回收率為（95.8±2.4）%～（118.3±6.2）%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件對組織中苯巴比妥的含量進(jìn)行方差分析及t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié) 果

2.1 中毒癥狀 大鼠在苯巴比妥灌胃后活動(dòng)明顯減少，出現(xiàn)嗜睡癥狀，LD50組灌胃7.24h±3.17h后死亡，2LD50組灌胃1.33h±0.25h后死亡。

圖1 染毒大鼠肝臟中苯巴比妥氣相色譜圖

2.2 GC和GC／MS檢測 苯巴比妥和丙烯巴比妥保留時(shí)間分別為10.45min和6.66min，峰形對稱，可完全分離，溶劑和空白臟器提取內(nèi)源性雜質(zhì)對苯巴比妥和丙烯巴比妥無干擾。詳見圖1～圖6。

圖2 染毒大鼠肝臟中苯巴比妥總離子流色譜圖

圖3 染毒大鼠肝臟中苯巴比妥質(zhì)譜圖

圖4 染毒大鼠肝臟添加內(nèi)標(biāo)物丙烯巴比妥質(zhì)譜圖

圖5 苯巴比妥的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

圖6 丙烯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

2.3 兩組大鼠體內(nèi)苯巴比妥的含量（見表1）

表1 苯巴比妥在大鼠體內(nèi)的死后分布 μg／g

表1 苯巴比妥在大鼠體內(nèi)的死后分布 μg／g

組別 n心血 心 肝 脾 肺 腎 腦 胃LD50組 6 269.52±44.62 305.88±70.87 282.76±79.44 272.56±31.53 277.58±67.47 156.61±43.72 271.56±71.43 1 261.34±591.83 2LD50組 6 309.93±135.6 310.95±130.73 357.83±138.67 299.77±104.58 308.28±134.48 233.24±91.92 323.19±159.92 1 649.21±1 212.82

3 討 論

本研究建立了苯巴比妥染毒大鼠的死后分布模型。不同劑量（LD50、2LD50）苯巴比妥灌胃后在7.24 h±3.17h 和1.33h±0.25h內(nèi)死亡，考慮劑量的影響，從而研究死亡當(dāng)時(shí)各臟器中藥物的分布狀態(tài)與劑量的關(guān)系。此模型簡便易復(fù)制，可應(yīng)用于苯巴比妥的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究［10，11］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各臟器組織苯巴比妥含量由高到低分別為，LD50組：胃＞心、腦、肝、肺、脾、心血＞腎（P ＜0.05）；2LD50組：胃＞肝、腦、心、心血、肺、脾＞腎（P ＜0.05）。說明苯巴比妥死后分布不均勻，主要分布于含血豐富和脂質(zhì)含量高的器官和組織中如肝、肺、心、腦。因此，藥物的死后分布特征可能與組織的血流量、脂質(zhì)含量和藥物的酸堿性、脂溶性高低有關(guān)［12－14］。其次，胃內(nèi)藥物濃度最高，說明口服途徑給藥，存在未被吸收的藥物；腎臟藥物濃度最低，說明死亡當(dāng)時(shí)藥物在體內(nèi)處于吸收分布時(shí)相，而未達(dá)到排泄時(shí)相。最后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明劑量對死后分布趨勢無影響。本實(shí)驗(yàn)在死后分布模型的制備中未對染毒大鼠死亡時(shí)間進(jìn)行控制。因此，需進(jìn)一步研究死亡時(shí)間是否對死后分布結(jié)果存在影響。

對懷疑苯巴比妥中毒（死）案件進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定：①心血、心、肝、肺、腦是較好的檢材，其濃度能反映中毒當(dāng)時(shí)的真實(shí)濃度，但要注意準(zhǔn)確全面的取材及死后再分布的影響。②由于胃內(nèi)有未被吸收的藥物，不適合用于推斷中毒死亡當(dāng)時(shí)的濃度，但可以推斷給藥途徑。③通過對死亡當(dāng)時(shí)各臟器的分布狀態(tài)，結(jié)合動(dòng)態(tài)分布，推斷死亡時(shí)所處時(shí)相，進(jìn)而推斷死亡時(shí)間。在法醫(yī)案件中判斷死亡當(dāng)時(shí)濃度、給藥途徑和死亡時(shí)間，需要考慮到各種影響因素，全面、合理的分析，得出正確的鑒定結(jié)果，為案件的偵破提供一定的依據(jù)。

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