李 彬，劉 飛，李昇樂(lè)，李英杰，冷小京

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

酪蛋白磷酸肽鈣-乳清蛋白復(fù)合膜物理性質(zhì)的研究

李 彬，劉 飛，李昇樂(lè)，李英杰，冷小京*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

在乳清分離蛋白(WPI)基礎(chǔ)膜中引入酪蛋白磷酸肽鈣(CPPs)制備成富鈣的單層復(fù)配膜和雙層復(fù)合膜，并對(duì)膜的有關(guān)物理性質(zhì)(機(jī)械強(qiáng)度、含水量、水蒸氣透過(guò)系數(shù))進(jìn)行評(píng)價(jià)。單層復(fù)配膜中CPPs與WPI的最大百分比為8%，總鈣含量最高為0.59%。CPPs的添加量對(duì)所測(cè)膜的物理性質(zhì)沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。雙層復(fù)合膜可使總鈣含量高達(dá)28%以上，但同時(shí)也使膜的機(jī)械強(qiáng)度較單層復(fù)配膜降低近一半，且含水量顯著降低(P＜0.05)。

酪蛋白磷酸肽鈣；乳清分離蛋白；單層復(fù)配膜；雙層復(fù)合膜

乳清蛋白是乳清液的主要成分，可形成柔軟、有彈性、不溶于水的可食用包裝膜[1-2]，且具有良好的阻隔氧氣、芳香物質(zhì)和油脂的性能[3]。隨社會(huì)需求的發(fā)展，提高相關(guān)膜產(chǎn)品的多功能特性成為食品科學(xué)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。比如，為增強(qiáng)可食用膜的抗菌性能，Seydim[4]、Cagri[5]、Franssen[6]等在膜中加入大蒜精油、山梨酸等抑菌劑；為提高膜的營(yíng)養(yǎng)特性，Mei等[7]利用蛋白質(zhì)高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)搭載維生素、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣等功能因子。值得注意的是，合理有效地設(shè)計(jì)可食用包裝膜中鈣的組成，強(qiáng)化食品中鈣的含量，對(duì)改善我國(guó)目前膳食結(jié)構(gòu)中普遍存在的鈣攝入量偏低[8-9]的問(wèn)題，更有現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值。

在乳清蛋白膜中提高鈣的含量很不容易[10-11]。因?yàn)殁}離子的加入過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白凝聚，無(wú)法形成膜。此外，無(wú)機(jī)鈣離子在腸道中性或微堿環(huán)境中極易與氫氧根、磷酸根等離子形成水不溶性鹽，也影響鈣的吸收利用。酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide，CPPs)是一類富含-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-結(jié)構(gòu)的生物活性肽[12]，它可以和金屬離子，特別是鈣離子結(jié)合形成可溶性復(fù)合物，即酪蛋白磷酸肽鈣，這種復(fù)合物可以有效阻止鈣在小腸的中性或微堿性環(huán)境中形成沉淀[13]。因此，以乳清蛋白膜承載CPPs，不但有可能提高乳清蛋白膜的總鈣含量，還可以提高人體對(duì)鈣的利用率。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CPPs與乳清蛋白(whey protein isolate，WPI)復(fù)配可食用膜報(bào)道不多，數(shù)據(jù)缺乏，因此本研究的重心是通過(guò)WPI與CPPs的復(fù)配，形成富鈣的單層或雙層包裝膜，并探討其物理性能，為此方面工作的展開(kāi)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(WPI，蛋白質(zhì)含量≥97%) 美國(guó)Davisco食品公司；酪蛋白磷酸肽鈣(CPPs，純度≥80%，鈣含量7.4%) 廣州美晨集團(tuán)股份有限公司；甘油、NaOH均為分析純 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8B型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱寧波江南儀器廠；數(shù)顯千分尺成都成量有限公司；CAL1501鈣離子選擇電極美國(guó)Van London-pHoenix公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀美國(guó)FCT公司；DelsaNano納米粒度及Zeta電位分析儀美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Hitachi S-5500超高分辨率掃描電子顯微鏡日本日立公司。

1.3 樣品制備

溶液Ⅰ：稱取一定質(zhì)量的WPI溶于去離子水中，使溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，攪拌2h使其完全溶解，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至8，90℃水浴處理30min[14]。

溶液Ⅱ：稱取一定質(zhì)量的CPPs溶于去離子水中，使溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，攪拌至完全溶解，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至8。CPPs的最大溶解量為40%，但CPPs在30%和40%時(shí)鋪成的膜有龜裂趨勢(shì)，因此選20%作為雙層復(fù)合膜的第二層膜。

1.3.1 CPPs-WPI單層復(fù)配膜的制備

將溶液Ⅱ緩慢加入溶液Ⅰ中，并添加一定量甘油(Glycerin:WPI 體積比 1:2)和一定量的去離子水?dāng)嚢杈鶆蚝蟪暶摎?0min得成膜液。體系終含量：WPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，CPPs與WPI的質(zhì)量百分比分別為0%、1%、3%、5%、7%和8%。稱量5g成膜液，倒入有機(jī)玻璃皿(直徑8cm)中，在恒溫恒濕箱內(nèi)(T = (22 ± 2)℃，RH =(56 ± 2 )%)平衡48h成膜，并立刻開(kāi)始測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 雙層復(fù)合膜的制備

分別稱取上述CPPs最大添加量的成膜液3、2.5、2g倒入有機(jī)玻璃皿(直徑8cm)中，在恒溫恒濕箱內(nèi)(T=(22±2)℃，RH=(56±2)%)平衡48h后，再分別稱取溶液Ⅱ 2、2.5、3g均勻覆蓋在上述已平衡的膜上，在恒溫恒濕箱內(nèi)(T=(22±2)℃，RH=(56±2)%)平衡48h成膜，并立刻開(kāi)始測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 膜微觀形態(tài)掃描電鏡分析

待測(cè)的膜樣品經(jīng)過(guò)液氮冷凍處理，保持截面的原始狀態(tài)，然后用高純銀漿將其固定在鋁片上，風(fēng)干后噴碳，用掃描電鏡觀察截面。

1.5 單層復(fù)配膜成膜液研究

1.5.1 相應(yīng)濃度CPPs水溶液中游離鈣含量的測(cè)定

單層復(fù)配膜成膜液中溶液Ⅰ用等量的去離子水替代，配制成相應(yīng)濃度CPPs水溶液，用鈣離子選擇電極測(cè)水溶液中游離鈣含量。

1.5.2 成膜液電勢(shì)和粒徑的測(cè)定

單層復(fù)配膜成膜液的Zeta電勢(shì)和粒徑用DelsaNano納米粒度及Zeta電位分析儀測(cè)量。

1.6 單層復(fù)配膜和雙層復(fù)合膜性能的測(cè)定

1.6.1 膜厚度

選擇完好、均勻的膜，隨機(jī)取10個(gè)點(diǎn)，用數(shù)顯千分尺測(cè)量其厚度，取平均值。

1.6.2 拉伸性能

參照GB/T12914— 91《紙與紙板抗張強(qiáng)度測(cè)定方法》[15]，略有改動(dòng)，使用TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀的拉伸裝置，拉伸速度為1mm/s。拉伸強(qiáng)度(TS，N/mm2)和斷裂拉伸率(E，%)可從壓力-應(yīng)變曲線上計(jì)算獲得。每個(gè)膜樣品的大小為40mm×6mm。

式中：Ft為最大拉力/N；L為膜樣品的厚度/mm；W為膜樣品的寬度/mm。

式中：L0為樣品拉伸前的原始長(zhǎng)度/mm；ΔL為樣品斷裂時(shí)被拉長(zhǎng)的長(zhǎng)度/mm。

1.6.3 水蒸氣透過(guò)系數(shù)

水蒸氣透過(guò)系數(shù)(water vapor permeability，WVP)是指保持試樣兩表面特定的溫濕度環(huán)境，在單位時(shí)間內(nèi)，由試樣兩側(cè)單位水蒸氣壓差引起的，單位厚度的樣品在其單位面積上透過(guò)的水蒸氣總量。測(cè)量方法采用擬杯子法。參照GB1037—88《塑料薄膜和片材透水蒸氣試驗(yàn)法 杯式法》，并略有改動(dòng)[16]。將完整均勻的膜密封在自制有機(jī)玻璃透濕杯表面，膜外露面積為19.6cm2，杯內(nèi)裝有30g干硅膠。將透濕杯放入恒溫恒濕箱內(nèi)(T = (22 ± 2)℃，RH = (56 ± 2)%)平衡2h，然后測(cè)6h后透濕杯的增加質(zhì)量。按式(3)計(jì)算膜的WVP的值。

式中：m為透濕杯的增加質(zhì)量/g；x為膜的厚度/mm；A為膜外露面積/cm2；t為測(cè)量間隔時(shí)間/h；ΔP為膜兩側(cè)的水蒸氣壓差/kPa 。

1.6.4 含水量(MC)

稱取質(zhì)量為m0的膜放在105℃的烘箱中干燥24h，稱質(zhì)量，計(jì)算干燥前后膜質(zhì)量損失為Δm。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.0和SPSS 16.0軟件。樣品顯著性分析采用單向方差分析和鄧肯多重比較法(α=0.05)，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜電鏡圖像分析

圖1為相關(guān)膜樣品截面的電子掃描圖像。其中A為純WPI膜的截面圖，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比較均勻光滑，這與已有的研究結(jié)果相符[11]。隨著CPPs量的增加，截面逐漸出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，如圖B所示。此聚集現(xiàn)象與CPPs中鈣含量的增加有關(guān)系。圖C為放大500倍的雙層復(fù)合膜截面圖，圖中可以看到明顯的界面。膜厚度約100μm。圖D為放大105倍的雙層復(fù)合膜截面圖，同樣可以看見(jiàn)雙層膜之間有十分明顯的界面，下層為WPI與CPPs的復(fù)配膜，上層為純CPPs膜，比較均勻光滑。雖然雙層之間截面比較明顯，但因蛋白質(zhì)分子與肽段分子之間的各種相互作用，如氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力等[17]，使雙層膜互相結(jié)合緊密，無(wú)法再分開(kāi)。

圖1 膜樣品截面掃描電鏡圖Fig.1 SEM micrographs of the film cross sections

2.2 游離鈣作用的分析

前期研究表明[11]，在8%的WPI成膜液中，當(dāng)Ca2+的含量超過(guò)0.45%，蛋白體系會(huì)迅速凝膠而無(wú)法成膜。圖2展示了隨著CPPs-WPI混合比例的上升，體系中游離Ca2+含量的變化趨勢(shì)。當(dāng)CPPs-WPI混合比例達(dá)到最大值8%時(shí)，雖然體系總鈣含量為0.59%，已超過(guò)了上述的凝膠極限，但由于游離Ca2+含量為0.34%，仍低于極限濃度，故未導(dǎo)致凝膠發(fā)生。這說(shuō)明CPPs具有降低游離Ca2+含量的能力，而體系凝膠現(xiàn)象僅取決于游離Ca2+的含量，而非體系總鈣含量。

圖2 CPPs水溶液體系中游離鈣離子的含量Fig.2 Free calcium content in the CPPs solutions

2.3 電勢(shì)與粒徑分析

圖3 成膜液的Zeta電勢(shì)和粒徑測(cè)量Fig.3 Zeta potential and size measurements of the film solution

圖3描述了隨CPPs添加量的增大，單層復(fù)配膜成膜液的電勢(shì)絕對(duì)值和粒徑均呈下降的趨勢(shì)。因?yàn)閃PI的等電點(diǎn)在5.1附近，所以蛋白質(zhì)分子在pH8條件下帶負(fù)電荷。分子間靜電斥力的存在可導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合物處于膨脹狀態(tài)，粒徑較大。加入CPPs可使體系內(nèi)游離Ca2+含量上升(圖2)。Ca2+對(duì)蛋白質(zhì)分子表面負(fù)電荷的靜電中和，降低了分子的表面電勢(shì)，減弱了分子間的電荷斥力，形成緊密的蛋白質(zhì)-鈣-蛋白質(zhì)鈣橋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聚合物收縮，粒徑降低。在膜的形成過(guò)程中，這種聚集收縮會(huì)造成如圖1B所展示的顆粒狀膜結(jié)構(gòu)。類似現(xiàn)象在文獻(xiàn)中多有報(bào)道[18-19]。盡管CPPs的加入可有效提高膜體系的總鈣含量，但游離鈣離子引發(fā)蛋白分子聚集，最終仍影響膜的形成，因此CPPs的使用仍然存在用量極限問(wèn)題。雙層膜的設(shè)計(jì)可大幅度提高膜體系中總鈣的含量。

2.4 膜的機(jī)械強(qiáng)度

圖4比較了隨著CPPs添加量的增加，單層及雙層膜各樣品拉伸強(qiáng)度(TS)和斷裂拉伸率(E)的相對(duì)差異。由圖4可見(jiàn)，在單層復(fù)配膜體系中，TS和E并無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道存在不同，據(jù)報(bào)道，在乳清蛋白加熱變性過(guò)程中，蛋白凝膠的機(jī)械性能主要由分子間相互作用如氫鍵、疏水相互作用、范德華力及雙硫鍵等決定。Ca2+加入后，若游離散布在整個(gè)體系內(nèi)，可借助靜電作用來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子間的反應(yīng)。雖然其作用效果小于加熱處理[13]，但低含量的Ca2+仍能顯著提高膜的機(jī)械性能[20-21]。而當(dāng)體系中加入CPPs后，因肽鏈上磷酸根功能團(tuán)的吸引，游離Ca2+不易擴(kuò)散到整個(gè)體系中，難以使膜的整體機(jī)械性能發(fā)生顯著變化。與單層復(fù)配膜相比，雙層復(fù)合膜的拉伸性能大幅度下降。這是因?yàn)?，首先，純CPPs層的原料屬于酪蛋白水解產(chǎn)物，肽段較短，無(wú)法交聯(lián)形成高機(jī)械強(qiáng)度的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；其次，雙層膜中提供機(jī)械強(qiáng)度的主要部分是CPPs/WPI復(fù)配膜層，與同質(zhì)量的單層復(fù)配膜體系相比，雙層膜體系中CPPs/WPI的用量相對(duì)較少，因此膜整體的機(jī)械強(qiáng)度也隨之降低。

圖4 樣品的拉伸強(qiáng)度和斷裂拉伸率Fig.4 Tensile strength (TS) and elongation rate (E) of different sample films

2.5 膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)(WVP)及含水量(MC)

圖5 樣品的水蒸氣透過(guò)率和含水量Fig.5 Water vapour permeability (WVP) and moisture content (MC) of different sample films

圖5比較了隨著CPPs添加量的增加，各樣品WVP及MC的相對(duì)差異。需要說(shuō)明的是，因WVP是均勻材料的特性參數(shù)，所以本實(shí)驗(yàn)忽略了單層與雙層膜WVP的對(duì)比[22]。單層復(fù)配膜的WVP差異不顯著(P＞0.05)。WVP與膜中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的微小通道有關(guān)[16]，并受很多因素如膜的完整性、結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)的比例、疏水區(qū)和親水區(qū)的比例、高分子鏈的流動(dòng)性等的影響。此外，Ca2+可以在蛋白膜中形成分子交聯(lián)，強(qiáng)化蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并提高其阻水性能[20]；然而蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的不均勻性又會(huì)形成新的通道；此外，CPPs較強(qiáng)的水溶性和Ca2+的吸濕性也有助于水分子的通過(guò)。數(shù)種作用相互平衡，從而使體系WVP的綜合變化不明顯。MC的特征與WVP表現(xiàn)不同。在單層復(fù)配膜中，隨CPPs的增加，MC呈下降趨勢(shì)。MC是表達(dá)膜微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中水分子所占體積的參數(shù)，反映了膜的持水能力[16]。如圖1所示，隨著CPPs含量的增加，鈣含量增多，膜內(nèi)蛋白分子呈現(xiàn)自聚集趨勢(shì)，膜內(nèi)自由體積減少，因而導(dǎo)致MC降低。雙層復(fù)合膜的MC較單層復(fù)配膜顯著降低(P＜0.05)，這主要是因?yàn)殡p層復(fù)合膜中的純CPPs層持水性能很弱，降低了整體的性能。

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)WPI與CPPs的復(fù)配，可制備具有補(bǔ)鈣功能的新型可食用膜體，提高了包裝膜的營(yíng)養(yǎng)功能特性。

3.2 單層膜中CPPs的添加使膜的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，蛋白分子之間發(fā)生了聚集現(xiàn)象，但膜的相關(guān)物理性質(zhì)(機(jī)械強(qiáng)度、含水量、水蒸氣透過(guò)系數(shù))變化并不顯著(P＞0.05)。此外，與直接添加無(wú)機(jī)鈣相比，CPPs的添入不僅提高了膜體總鈣含量，還提高了鈣的利用率。

3.3 雙層復(fù)合膜的設(shè)計(jì)解決了單層膜載鈣量過(guò)低的問(wèn)題，總鈣最高含量可超過(guò)28%。然而膜的機(jī)械強(qiáng)度較單層膜降低了近一半。

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Physical Properties of Blended Film with Whey Protein Isolate and Casein Phosphopeptide

LI Bin，LIU Fei，LI Sheng-le，LI Ying-jie，LENG Xiao-jing*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The preparation and characterization of the single- and double-layer edible packaging films using the casein phosphopeptide (CPPs) and whey protein isolate (WPI) were performed in this study. The CPPs content could reach 8% (Ca/WPI) in the single-layer composite film and the calcium contained could attain 0.59% (Ca/WPI). Addition of CPPs had no significant effects on the physical properties (moisture content, water vapour permeability, tensile properties etc.) of the singlelayer films (P ＞0.05). The double-layer film was designed to increase the calcium content, and the maximum content of calcium could be above 28% (Ca/WPI); however, its tensile strength and moisture content were reduced compared with the single-layer one (P ＜0.05).

casein phosphopeptide；whey protein isolate；single-layer composite films；double-layer composite films

TS201.21

A

1002-6630(2011)03-0001-05

2010-04-16

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z311)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A06)

李彬(1988—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭秤媚ぜ拔⒛z囊科學(xué)。E-mail：siyulibin@163.com

*通信作者：冷小京(1966—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榭墒秤媚ぜ拔⒛z囊科學(xué)。E-mail：xiaojing.leng@gmail.com