余盼攀，張勝初，季世強(qiáng)，蘇龍豐，張啟瑜

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325035）

Knook等[1]在1982年采用膠原酶、鏈霉蛋白酶原位循環(huán)灌注法首先成功地分離出大鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC），標(biāo)志著HSC研究的開始。HSC是目前肝纖維化研究的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)?；罨腍SC能分泌細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子，在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中扮演了重要的角色。原代HSC和體外活化的細(xì)胞株具有不同的生物學(xué)特點(diǎn)，原代HSC適合靜止HSC的生物學(xué)特性的研究。體內(nèi)絕大部分HSC是以靜止?fàn)顟B(tài)存在，所以對(duì)原代HSC的研究更有實(shí)際意義。原代HSC的分離難度大，成功率低，建立一種合理、經(jīng)濟(jì)、便捷的分離方法實(shí)屬必要。本研究在國內(nèi)外大鼠HSC分離培養(yǎng)基礎(chǔ)上采用改良的Optiprep密度梯度離心法成功分離出大鼠HSC，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量500～600 g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，常規(guī)喂養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食。

1.2 試劑及儀器 IV型膠原酶（type IV collagenase）、DNA酶I（DNaseI）、D-Hanks液均購自美國Sigma公司，Optiprep分離遞質(zhì)購自挪威Axis-shield公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。大鼠α-SMA單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗購自武漢博士德公司。倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，高速離心機(jī)購自美國Beckman公司。

1.3 分離用液 前灌注液：D-Hanks液500 mL+肝素鈉1 mL預(yù)熱至37 ℃。酶灌注液：Hanks 100 mL+IV型膠原酶0.05 g+DNA酶I 0.03 g預(yù)熱至37 ℃。震蕩消化液：同酶灌注液。終止消化液：DMEM培養(yǎng)液10 mL+胎牛血清5 mL預(yù)冷至4 ℃。細(xì)胞洗滌液：Hanks 50 mL+DNA酶I 0.02 g。離心液：10%離心液（60% Optiprep原液0.8 mL+D-Hanks液4.17 mL）；16%離心液（60% Optiprep原液1.5 mL+D-Hanks液3.5 mL）。各液體中分別加入1%青鏈霉素。

1.4 分離方法

1.4.1 原位消化：大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉30 mg/mL麻醉后，固定于操作臺(tái)上，腹部備皮，75%酒精消毒后取大十字切口進(jìn)腹。肝臟稍作分離，顯露肝上下腔靜脈同時(shí)游離肝下下腔靜脈帶線備用。游離門靜脈主干1.5 cm帶線備用，側(cè)支予以結(jié)扎。血管夾夾閉門靜脈遠(yuǎn)端，近端置18號(hào)留置針并固定，同時(shí)夾閉肝上下腔靜脈，剪開肝下下腔靜脈，用50 mL針筒緩慢推注前灌注液。

1.4.2 離體消化：當(dāng)肝臟表面顏色變?yōu)榛野讜r(shí)迅速游離肝臟置于無菌小彎盤。換酶灌注液繼續(xù)灌注10 min，待肝包膜下肝組織完全軟化幾乎成液體時(shí)停止消化。

1.4.3 細(xì)胞分散及純化：將肝臟轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，剪開包膜，剔除結(jié)締組織，剪碎肝組織放入50 mL離心管中加入震蕩消化液于37 ℃震蕩消化20 min，結(jié)束后加入15 mL終止消化液。所得細(xì)胞懸液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾2次，移入2個(gè)50 mL離心管中，加入細(xì)胞洗滌液充分吹打分散細(xì)胞。65 g離心10 min去除肝細(xì)胞，上清分別移入2只50 mL離心管中，500 g離心10 min，取沉淀。2管合為1管，用40 mL細(xì)胞洗滌液重懸細(xì)胞，再次500 g離心10 min，取沉淀。

1.4.4 Optiprep密度梯度離心：上述細(xì)胞沉淀加入16% Optiprep 5 mL重懸，終濃度為12%，再輕輕上覆10% Optiprep 5 mL，再以同樣的方法上覆5 mL D-Hanks液，于4 ℃ 1400 g密度梯度離心17 min，輕輕取出離心管，用玻璃注射器小心吸出上層D-Hanks液與10% Optiprep液界面灰白色的細(xì)胞條帶，用洗滌液以500 g，7 min漂洗2次，用含20%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，移出部分用于細(xì)胞鑒定外其余移入培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 鑒定方法

1.5.1 新鮮HSC產(chǎn)量的測(cè)定：倒置相差顯微鏡下，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量。

1.5.2 活細(xì)胞率鑒定方法：臺(tái)盼藍(lán)排斥反應(yīng)：取細(xì)胞懸液90μL加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)10μL后滴加到載玻片上，顯微鏡下計(jì)算未染色的活細(xì)胞數(shù)。

1.5.3 性質(zhì)鑒定方法：熒光顯微鏡下觀察當(dāng)激發(fā)波長為328 nm時(shí)出現(xiàn)自發(fā)熒光的細(xì)胞即為新鮮分離的肝星狀細(xì)胞。六孔板中放入在蓋玻片，待細(xì)胞爬片后采用α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。

1.6 培養(yǎng)及傳代方法 將細(xì)胞以5×105/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后首次換液去除未貼壁的細(xì)胞。以后每2～3天換液一次，待細(xì)胞長滿瓶底時(shí)0.25%胰酶消化傳代。

2 結(jié)果

2.1 HSC的形態(tài)觀察 在熒光顯微鏡下能見到新鮮分離細(xì)胞的自發(fā)淡藍(lán)色熒光，見圖1。在相差顯微鏡下，新分離的HSC呈圓形，具有很強(qiáng)的折光性，體積明顯小于肝細(xì)胞，見圖2。接種30 min即可出現(xiàn)貼壁，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞90%貼壁，多呈紡錘形、多角形。培養(yǎng)至5 d左右細(xì)胞外觀呈現(xiàn)出明顯的星形，胞漿內(nèi)顆粒減少，細(xì)胞逐漸融合成片狀生長，見圖3。培養(yǎng)至14 d細(xì)胞全部活化，胞漿內(nèi)脂滴基本消失，體積增大。

圖1 新鮮分離的HSC自發(fā)熒光（×400）

圖2 新鮮分離的HSC（×100）

圖3 體外培養(yǎng)5 d的HSC（×200）

圖4 傳5代后HSCα-SMA染色（SABC，×200）

2.2 HSC的得率和存活率 采用Optiprep密度梯度離心法分離SD大鼠肝星狀細(xì)胞，大鼠平均每只重500 g，平均得率為2×107個(gè)/肝。經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率在90%以上。

2.3 HSC純度鑒定 α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，新鮮分離的肝星狀細(xì)胞α-SMA染色陰性，傳5代后α-SMA陽性細(xì)胞達(dá)95%以上，見圖4。

3 討論

HSC是四種肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的一種，首先由Kuffer在1876年發(fā)現(xiàn)。1996年美國肝病會(huì)議將其統(tǒng)一命名為肝星狀細(xì)胞（HSC）[2]。目前大量的抗纖維化研究都是圍繞著HSC的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)歸而開展的[3]。靜止的HSC在體外能迅速活化，所以要研究靜止HSC的生物學(xué)特性必須采用新鮮分離的HSC。國內(nèi)外關(guān)于大鼠HSC分離培養(yǎng)的方法報(bào)道甚多[4-8]，但也有一些不足，如單用原位循環(huán)灌注酶液雖然操作簡單，但由于肝臟與鄰近器官側(cè)支循環(huán)豐富，這樣不但增加酶的用量，增加分離成本，而且酶容易經(jīng)側(cè)支循環(huán)流向其他器官而影響灌注的效果；鏈酶蛋白酶雖然可以去除部分肝細(xì)胞，提高星狀細(xì)胞純度，但對(duì)星狀細(xì)胞亦有較大的損傷；采用蠕動(dòng)泵灌注雖然速度壓力較均勻，但起初灌注時(shí)需要較高的壓力迅速?zèng)_洗肝臟內(nèi)血液及其他雜質(zhì)，而當(dāng)灌注酶液時(shí)由于酶與肝細(xì)胞需要一定的反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)則需要較低的灌注壓。我們經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)出影響HSC得率、純度、活力的主要因素及改進(jìn)方法，介紹如下：

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量要大于400 g，并且營養(yǎng)狀況要好，這樣才能保證有足夠的細(xì)胞數(shù)并且使HSC含有更多的脂滴，有利于密度梯度的形成。術(shù)前1個(gè)月給予每周兩次腹腔注射維生素A對(duì)密度梯度的形成有一定的幫助。

3.2 酶的類型及濃度 我們僅使用IV型膠原酶和DNA酶I而沒有使用鏈酶蛋白酶，發(fā)現(xiàn)HSC得率并沒有明顯下降反而細(xì)胞活力有所提高，說明鏈酶蛋白酶并非必需。在配置各種液體時(shí)要確保濃度準(zhǔn)確，若酶濃度過高則對(duì)細(xì)胞的損傷大，若過低則達(dá)不到充分消化的目的，影響HSC的得率。值得注意的是，對(duì)各種實(shí)驗(yàn)用液要在實(shí)驗(yàn)前預(yù)冷或預(yù)熱到適當(dāng)溫度，以保證達(dá)到最佳的效果。

3.3 合適的灌注壓力及消化時(shí)間 必須掌握好合適的灌注壓。若壓力過大，細(xì)胞容易發(fā)生機(jī)械損傷，若過小則延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間亦會(huì)影響細(xì)胞的活力。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采用注射器人工推注的方法根據(jù)實(shí)際推注時(shí)阻力大小調(diào)整灌注速度和壓力（約10～15 mL/min）提高了灌注效率，減少細(xì)胞損傷，取得較好效果。灌注、震蕩消化時(shí)間尤為重要。我們通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)得出離體灌注酶液約10 min后剪碎肝組織后再37 ℃震蕩消化20 min效果最好。

3.4 肝臟的處理 在游離肝臟時(shí)應(yīng)盡量結(jié)扎除肝下下腔靜脈外所有與外界相通的管道，并且避免肝臟損傷，這樣才能保證整個(gè)肝臟灌注均勻、完全。值得一提的是，離體灌注結(jié)束后用組織剪先剔除肝包膜及肝內(nèi)血管、膽管以減少雜質(zhì)的混雜，而后剪碎肝組織，確保能充分消化以提高細(xì)胞得率。

3.5 分離遞質(zhì)的選擇及配置 高質(zhì)量的分離遞質(zhì)是HSC分離成功的關(guān)鍵因素。目前國內(nèi)學(xué)者多采用Percol或Nycodenz作為分離遞質(zhì)，我們通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Percol雖然價(jià)格較低，但很難形成明顯的細(xì)胞條帶。Nycodenz為固體，溶解度小，配置過程容易污染且濃度誤差較大。因此我們采用Optiprep作為分離遞質(zhì)，發(fā)現(xiàn)與Percol、Nycodenz相比其對(duì)細(xì)胞損傷較小，液體配置更加簡便、準(zhǔn)確且細(xì)胞條帶更明顯，細(xì)胞純度、得率亦較高。重要的是分離用液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，配之前必須充分混勻原液，以避免密度不均。我們采用D-Hanks液稀釋60% Optiprep至10%、16%，加10% Optiprep和最上層D-Hanks時(shí)一定要沿管壁慢慢流下，保證加完以后能形成明顯的分層。

3.6 密度梯度的形成及細(xì)胞獲取 密度梯度的形成除優(yōu)質(zhì)的分離遞質(zhì)外離心機(jī)的正確使用至關(guān)重要，離心時(shí)務(wù)必將離心機(jī)調(diào)成慢制動(dòng)狀態(tài)，并且溫度設(shè)置為4 ℃，避免快速制動(dòng)后層面發(fā)生混雜及溫度過高影響細(xì)胞活性。離心完取細(xì)胞條帶時(shí)盡量保持注射器垂直，緩慢向上吸取細(xì)胞層，避免過快時(shí)吸到層面下的Kupffer細(xì)胞影響HSC的純度。

當(dāng)然整個(gè)分離過程必須保證嚴(yán)格無菌，操作過程必須熟練，盡量縮短分離時(shí)間，否則影響細(xì)胞活力。

綜上所述，我們采用原位預(yù)灌注含肝素的DHanks液后再離體灌注IV型膠原酶和DNA酶I，不僅大大節(jié)省了酶的用量，而且使得灌注更加完全、均勻。此方法提取的HSC產(chǎn)量、純度、活力都達(dá)到甚至超過了之前的分離方法，并且操作簡便，費(fèi)用較低，可以作為一種合理、經(jīng)濟(jì)、便捷的HSC提取方法。

[1] Knook DL, Seffelaar AM, Delleuw AM. Fat-storing cells of the rat liver:their isolation and purification[J]. Exp Cell Res,1982,139(2):468-471.

[2] Ahernmn M, Hall P, Halliday J, et al. Hepatic stellate cell nomenclature[J]. Hepatology,1996,23(1):193-193.

[3] Wang X, Tang X, Gong X, et al. Regulation of hepatic stellate cell activation and growth by transcription factor myocyte enhancerfactor 2[J]. Gastroenterology,2004,127(4):1174- 1188.

[4] 翁山耕, 冷希圣, 魏玉華. 改良法大鼠肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2001,33(1):83-86.

[5] Friedman SL, Roll FJ. Isolation and culture of hepatic lipocytes ,kupffer cells,and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with stractan[J]. Anal Biolchem,1987,161(1):207-218.

[6] Ramm GA. Isolation and culture of rat hepatic stellate cells[J]. J Gastroenterol Hepatol,1998,13(8):846-851.

[7] 王文兵, 戴立里, 鄭元義. 改良原位循環(huán)灌流法大鼠肝星狀細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 中華肝臟病雜志,2004,12(10):629-630.

[8] 羅云, 戴立里, 沈鼎明,等. 原位循環(huán)灌流法分離大鼠肝星狀細(xì)胞[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,27(1):48-49.