梁群，孫暉，蔣希成

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

密度感知系統(tǒng)(QS)是一種細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)傳遞機(jī)制，其應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生依賴細(xì)胞的閾值濃度，信號(hào)因子AHLS亦產(chǎn)生增多，被自身感知，便可激活QS系統(tǒng)，形成LasR－AHLS和RhlR－AHLS復(fù)合物，增強(qiáng)下游一系列毒性基因。LasR基因起關(guān)鍵與決定性作用［1］。本研究擬通過(guò)在銅綠假單胞菌培養(yǎng)的階段加入大蒜液，應(yīng)用PT－PCR技術(shù)觀察其在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)影響。

1 試劑與儀器

MMN反轉(zhuǎn)錄酶、總RNA提取試劑盒(TRIZOL Regent，Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、ThermoScript RT－PCR System(Invitrogen公司);Tris堿、EDTA、溴化乙啶(Sigma公司);引物(上海生工公司);DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量MarKer(DL2000，上海申能博采公司);DEPC(Amersco公司);銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1、銅綠假單胞菌Las及Rhl基因缺失PAOJP2(丹麥哥本哈根大學(xué)臨床微生物研究所吳紅博士提供);銅綠假單胞菌質(zhì)控菌ATCC27853;Muller－Hinton肉湯(MHB，美國(guó) DIFCO公司);胰酶大豆肉湯(TSB，法國(guó) bioMerieux公司);Muller－Hinton肉湯(MHA，美國(guó)DIFCO公司);比濁儀(法國(guó)bioMerieux公司);PCR擴(kuò)增儀(2720型，ABI公司);超聲振蕩清洗機(jī)(北京醫(yī)療儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(Bio－Vision++，法國(guó)VILBERLOURMAT公司);PCR電泳槽(小型水平電泳槽，BioRad公司);RT－PCR實(shí)驗(yàn)中所有的玻璃器皿均經(jīng)由0.1%DEPC水處理，放置在37℃的環(huán)境下2h，再用雙蒸水沖洗，然后經(jīng)過(guò)高壓滅菌的方式，在220℃的環(huán)境下烘烤4h。

2 方法

2.1 藥物制備

大蒜提取液:新鮮大蒜剝皮，取100g，用高錳酸鉀(1∶1000)溶液浸泡30min，以無(wú)菌蒸餾水洗滌2次，置于無(wú)菌的研缽內(nèi)搗成糊狀，按1∶1加無(wú)菌蒸餾水，混合后離心沉淀，取上清液(濃度為每毫升含生藥1g)存放備用。

2.2 分組

PAO1和PAO－JP2兩株菌。大蒜三個(gè)濃度組(40ug/ml、80ug/ml、100ug/ml)以及空白對(duì)照組，共計(jì)5組。

2.3 菌株的培養(yǎng)

1)挑取新鮮培養(yǎng)的銅綠假單胞菌PAO－JP2及PAO1單個(gè)菌落，放置于20ml的TSB肉湯中，以170r/min的頻率搖勻，時(shí)間為4～5h，將比濁儀的濃度調(diào)至0.5McFarland以便于備用。

2)分別吸取10ml的培養(yǎng)液置于無(wú)菌培養(yǎng)管中，依次調(diào)節(jié)大蒜液的濃度，使得最終濃度分別為40ug/ml、80ug/ml、100ug/ml，應(yīng)用震蕩培養(yǎng)的方法達(dá) 2 ～3h。

3)將震蕩后的培養(yǎng)液吸取入無(wú)菌離心管，高速離心10min，棄去上清液，并且將收集到的細(xì)菌標(biāo)本重新懸浮于1ml MH肉湯內(nèi)，4 000rpm離心10min，棄上清液備用。

2.4 細(xì)胞總RNA的提取(TRizol法)

1)在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入0.25%的胰蛋白酶1ml，消化時(shí)間為2min，繼續(xù)加入含10%FBS的MEM培養(yǎng)液2ml用于終止消化，然后將細(xì)胞附著面用彎頭吸管吹打，并將吸取細(xì)胞懸液到一個(gè)15ml的新離心管里，在室溫下，以8 000rpm的頻率離心5min。

2)加入1ml TRIZOL試劑到每個(gè)離心管中，將細(xì)胞用槍頭反復(fù)吹打，用5min的時(shí)間進(jìn)行室溫下孵育，將其吸入到1.5ml的新eppendorf管中，將0.2ml氯仿(三氯甲烷)加入每個(gè)管中，上下混勻翻倒15sec，然后在室溫條件下放置達(dá)3min的時(shí)間，在4℃，12 000×g的條件下離心15min。

3)將上清液吸入另一新的 eppendorf管中，將0.5ml異丙醇加入每個(gè)試管內(nèi)，在室溫條件下放置達(dá)10min，然后在4℃，12 000×g的條件下，離心10min;棄上清液，加入1ml75%的乙醇，然后4℃，7 500×g離心5min;棄去上清液，待沉淀干燥后，在每個(gè)試管內(nèi)加入30ul的DEPC－H2O以溶解沉淀。RNA的含量采用紫外分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定。

2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)

1)模板變性:5ul總 RNA、1ul Oligo(dT)20、2ul 10mM 的 dNTP Mix、4ul DEPC － Treated Water，65℃ 加熱5min用來(lái)溶化模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后立即冷卻于冰上。

2)反轉(zhuǎn)錄:直接加入5×cDNASynthesis Buffer 4ul、0.1M DTT 1ul、8ul總 cDNA、RNaseOUTTM(40u/ul)1ul、DEPC － TreatedWater1ul、ThermoScriptTMRT(15U/ul)1ul、合成cDNA、混合液在55℃的條件下反應(yīng)60min，在85℃的條件下反應(yīng)5min。

3)然后每支管加入1ul的RnaseH，在37℃的條件下放置20min;放入4℃冰箱作為暫時(shí)保存之用，若要長(zhǎng)久保存，則應(yīng)當(dāng)放入－70℃冰箱內(nèi)。

4)PCR 擴(kuò)增:Platinum Taq High Fidelity 0.5ul、50mM MgCl215ul、10uM antisense prime 1ul、10uM sense Primer 1ul、cDNA 合成 3ul、10 × HighFidelityPCRBuffer(無(wú)鎂)5ul、DEPC －TreatedWater37ul共計(jì)50ul。

5)PCR必需反應(yīng)條件:94℃5min;94℃30sec;60℃42sec;72℃42sec;72℃10min延伸;擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，4℃保存。

圖1 大蒜對(duì)銅綠假單胞菌LasR基因RT－PCR分析結(jié)果

3 結(jié)果

結(jié)果如圖1，左邊泳道為MarKer，由左及右依次為PAO－JP2陰性空白對(duì)照組、PAO－1陽(yáng)性空白對(duì)照組、大蒜液劑量組 40ug/ml、80ug/ml、100ug/ml，1 為 β－actin，大小為560bp，2為反義mRNA大小為210bp。PAO－1陽(yáng)性空白對(duì)照組可有效表達(dá)LasR基因，但明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系則隨著不同濃度的大蒜液加入培養(yǎng)基后被逐步表達(dá)了出來(lái)。同時(shí)，反義mRNA的表達(dá)量隨著亞抑菌濃度的增高也在逐步地減少，PAO－JP2陰性空白對(duì)照組由于缺失QS系統(tǒng)不能有效表達(dá)LasR基因。出現(xiàn)這種結(jié)果可能系大蒜抑制了QS系統(tǒng)的表達(dá)進(jìn)而影響到其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，可能大蒜生物活性成分結(jié)構(gòu)是否與AHL相類似的對(duì)調(diào)節(jié)器的轉(zhuǎn)錄子LuxR和LasR的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，有待一步研究。

4 討論

銅綠假單胞菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，可以導(dǎo)致很多種感染。QS系統(tǒng)是指細(xì)菌通過(guò)感知其群體的細(xì)胞密度，從而調(diào)控特定的基因活化與表達(dá)，并且通過(guò)感知周圍同伴的存在，達(dá)到一定的密度，從而表現(xiàn)出一定的行為。兩個(gè)聯(lián)級(jí)的QS系統(tǒng)包含在銅綠假單胞菌中，一組是控制某些二級(jí)代謝產(chǎn)物的RhIR－RhlI系統(tǒng)的主要基因，另一組是控制細(xì)胞外毒力因子表達(dá)的LasRLasI系統(tǒng)，在銅綠假單胞菌密度感知系統(tǒng)發(fā)揮作用的情況下，以及實(shí)現(xiàn)正反饋?zhàn)饔玫倪^(guò)程當(dāng)中，LasR－LasI基因起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)在不改變培養(yǎng)基的組份、氧濃度的情況下，研究大蒜液對(duì)LasR基因轉(zhuǎn)錄的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAO－1陽(yáng)性空白對(duì)照組可有效地表達(dá)出LasR基因，但隨著培養(yǎng)基中加入不同濃度的亞抑菌濃度的大蒜液后，劑量－效應(yīng)關(guān)系則被明顯地表達(dá)了出來(lái)，即隨著大蒜液亞抑菌濃度的增高，反義mRNA的表達(dá)量也在相應(yīng)地減少過(guò)程中。PAO－JP2陰性空白對(duì)照組由于缺失QS系統(tǒng)而不能有效表達(dá)LasR基因。這可能系大蒜液抑制了LasR基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了QS系統(tǒng)。AHLS是QS系統(tǒng)的產(chǎn)物，國(guó)外有報(bào)道發(fā)現(xiàn)大蒜液能降低AHLS的產(chǎn)生，本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果能夠說(shuō)明其部分原因。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外相關(guān)的報(bào)道結(jié)果一致［2－4］。另外，我們已知 QS系統(tǒng)可調(diào)控銅綠假單胞菌的致病因子外毒素A和彈性蛋白酶的產(chǎn)生，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了致病因子的產(chǎn)生是在基因水平上受到了大蒜液提取物的影響。

［1］Dong，YH，Gusti.Identification of quorum － quenching N － acylhomoserine Lactonnases from Bacillus species［J］.Appl Envion Microbiol，2002，68:1754 －1759.

［2］Catalina，AF.Hentzer M，Riedel K.Identifcation of quorum － sensing regulated proteins in the opportunisitic pathogen Pseudomonas aeruginosa by proteomics［J］.Envriomental Microbiology，2003，5(12):1350－1369.

［3］Kurreck J.Antisense technologies:Improvement through novel chemical modifications［J］.Eur J Biochem，2003，270:1628 －1644.

［4］Nouwens.Garlic blocks quorum sensing and promotes rapid clearing of pulmonary Pseudomonas aeruginose infections［J］.Microbiology，2005，6(11):1100－1117.