徐英杰，尹羽薇，董清平

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理特征的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，近年來(lái)其發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，具體病變主要涉及關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)周圍組織，關(guān)節(jié)軟骨與關(guān)節(jié)軟骨下骨［1］，是一種嚴(yán)重影響中老年人日?；顒?dòng)的常見(jiàn)骨科疾病。通過(guò)中藥超微粉治療兔骨性關(guān)節(jié)炎模型，并通過(guò)研究關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1及TIMP－1 mRNA表達(dá)的含量的變化，旨在探討他們?cè)诠切躁P(guān)節(jié)炎中的作用，為骨性關(guān)節(jié)炎的診治提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康成年雄性新西蘭白兔40只，普通級(jí)，體重(2.5±0.1)kg。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK黑2006－007］，將40只新西蘭白兔隨機(jī)分成模型組、通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組、傳統(tǒng)中藥組、中藥超微粉組4組，每組10只，右膝造模，并隨機(jī)選取10只左膝作為空白對(duì)照組。

1.2 造模方法

模型組、通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組、傳統(tǒng)中藥組、中藥超微粉組采用Hulth［2］造模方法并加以改進(jìn)制成兔骨性關(guān)節(jié)炎模型。取兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶。術(shù)后連續(xù)3天青霉素20萬(wàn)U肌肉注射，1周后開(kāi)始每天強(qiáng)迫兔活動(dòng)1h，連續(xù)4周。

1.3 中藥物配制

中藥超微粉方由元胡、川芎、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、續(xù)斷、當(dāng)歸、威靈仙、冰片組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制備。方法為取100倍處方量的醇提部分藥材，加50%乙醇浸泡1h，50%乙醇加熱回流2次(10倍，1.5h;8倍，1.0h);分別過(guò)濾，得醇提液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后水浴濃縮至干燥，粉碎備用，得細(xì)粉A。冰片緩慢加入50%乙醇溶解制成飽和溶液，得溶液B。將A粉與B液混合制成約每毫升含1g生藥的藥液C。取100倍處方量的粉碎部分藥材，用中藥粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩，得細(xì)粉D。將藥液C與細(xì)粉D充分混合得中藥超微粉貼劑。

通絡(luò)骨質(zhì)寧膏(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025964)。

1.4 儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Perkin Elmer公司);隨機(jī)寡核有酸引物oligo(dt)，逆轉(zhuǎn)錄酶RTase及Trizol液(GIBCO公司);Tap酶及dNTP(Promega公司);RNA酶抑制劑RNAsin(華美生物制品公司);寡核有酸引物(TaKaRa公司合成)。

2 治療方法

模型組，造模成功后，外敷醫(yī)用橡皮膏常規(guī)飼養(yǎng)6周。通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組，造模成功后，外敷通絡(luò)骨質(zhì)寧膏常規(guī)飼養(yǎng)6周。傳統(tǒng)中藥組，造模成功后，外敷傳統(tǒng)粉碎的中藥常規(guī)飼養(yǎng)6周。中藥超微粉組，造模成功后，外敷制備的中藥超微粉中藥，常規(guī)飼養(yǎng)6周。每日1次，每次12h，共治療6周。

3 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

3.1 關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1及TIMP－1 mRNA表達(dá)的含量的測(cè)定

取兔膝關(guān)節(jié)退變區(qū)軟骨及關(guān)節(jié)腔內(nèi)側(cè)滑膜去粗標(biāo)本，迅速置于無(wú)菌的研缽中，迅速研磨，待其研成粉末狀后，將粉末轉(zhuǎn)入離心管，以1ml Trizol試劑加入該管，劇烈搖晃震蕩2min后，室溫靜置5min。加入氯仿200ul，劇烈搖晃振蕩 1min，靜置 5min后 4℃ 離心(12 000r/min)15min。離心后管中液體分為3層:上層為無(wú)色透明的水相，RNA即留存于此相中。蛋白質(zhì)保留于下層的酚－氯仿相中。DNA保留于上下兩層間的中間層。將上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10min后，4℃離心(12 000r/min)10min。棄去離心后的上清液，用75%乙醇1ml將RNA沉淀洗滌，20℃靜置15min，繼之以4℃離心(7 500r/min)5min。棄上清，以無(wú)菌DEPC水200ul再溶解RNA沉淀，振蕩混勻后65℃加熱15min。將提取出的RNA備用或于－20℃保存。600℃加熱RNA樣品15min，后冰浴 10min。加入 10 × buffer(DNaseI)10ul，4ul(DnseI)，1ul inhibitor(40U/ul)，37℃ 水浴 30min。加入4ul DNaseI，37℃水浴30min。加入800ul Trizol后混勻，室溫下靜置5min。加入200ul氯仿，混勻，室溫下靜置5min。4℃離心12 000r/min，15min。將上清轉(zhuǎn)入另一只EP管中，加入500ul的100%冰乙醇，搖勻。－20℃ 冰箱中靜置 30min。4℃ 離心 12 000r/min，10min棄上清。加入500ul的75%乙醇(DEPC水配制)，混勻，室溫下靜置10min。4℃ 7 500r/min離心5min，棄上清。將RNA沉淀于真空狀態(tài)下45℃干燥5min。DEPC水50ul溶解RNA沉淀，振蕩，離心。室溫下靜置10min。

表1 基因的正向引物與反向引物的擴(kuò)增位置、擴(kuò)增長(zhǎng)度、退火溫度

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3.3 結(jié)果 見(jiàn)表2、圖1。

圖1 MMP－1與TIMP－1電泳圖

表2 治療4周后各組標(biāo)本中MMP－1 mRNA與TIMP－1 mRNA表達(dá)量(s)

表2 治療4周后各組標(biāo)本中MMP－1 mRNA與TIMP－1 mRNA表達(dá)量(s)

注:與模型組相比，*P＜0.01，與傳統(tǒng)中藥組及通絡(luò)骨質(zhì)寧膏比較，#P＜0.05。

空白對(duì)照組 模型組 傳統(tǒng)中藥組 通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組 中藥超微粉組MMP －1 0.297 ±0.062 0.819 ±0.109 0.594 ±0.061* 0.601 ±0.061* 0.462 ±0.062*#TIMP －1 0.307 ±0.048 0.156 ±0.055 0.363 ±0.042* 0.354 ±0.052* 0.432 ±0.048*#

結(jié)果顯示，正常組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1 mRNA表達(dá)量最低，模型組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1 mRNA的表達(dá)量最高，TIMP－1 mRNA的表達(dá)量較低;正常組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中TIMP－1 mRNA的表達(dá)量在各組中最低，傳統(tǒng)中藥組、通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組中藥超微粉組在治療后關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1 mRNA與模型組比較均有所降低(P＜0.01)，其中中藥超微粉組與傳統(tǒng)中藥組和通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組相比有差異(P＜0.05)。中藥超微粉組TIMP－1 mRNA的表達(dá)含量與傳統(tǒng)中藥組、通絡(luò)骨質(zhì)寧膏組相比有差異(P＜0.05)，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。

4 討論

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery systems，transdermal therapeutic systems，簡(jiǎn)稱 TDDS，TTS)系指經(jīng)皮膚敷貼方式用藥，藥物由皮膚吸收進(jìn)入局部，實(shí)現(xiàn)治療疾病的一類制劑。在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中，中藥的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)發(fā)展歷史悠久，經(jīng)過(guò)多年的傳承與發(fā)揚(yáng)，逐步形成完整的體系。所謂中藥經(jīng)皮給藥是指在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，將中藥單方或中藥復(fù)方經(jīng)過(guò)合理的提取、分離、純化等工藝所得到的有效部位或有效成分或其提取物等與適宜的輔料或基質(zhì)制成的通過(guò)皮膚表面給藥，使中藥以恒定速度(或接近恒定速度)通過(guò)皮膚各層，進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生局部或全身治療作用。

本組方中以骨碎補(bǔ)為君藥，活血續(xù)傷，補(bǔ)腎強(qiáng)骨，《開(kāi)寶本草》謂其“主破血止血，補(bǔ)傷折”。淫羊藿補(bǔ)腎助陽(yáng)，強(qiáng)筋壯骨，祛濕除濕，《日華子本草》言其主治“一切冷風(fēng)勞氣，筋骨攣急，四肢不仁，補(bǔ)腰膝”;續(xù)斷補(bǔ)腎強(qiáng)筋，療傷續(xù)折，《本草匯言》曰:“續(xù)斷，補(bǔ)續(xù)血脈之藥也。大抵所斷之血脈非此不續(xù);所傷之筋骨非此不養(yǎng);所滯之關(guān)節(jié)非此不利?！倍吖矠槌妓帲灾撬檠a(bǔ)補(bǔ)腎續(xù)傷之力。元胡“能行血中氣滯，氣中血滯，故專治一身上下諸痛”(《本草綱目》);川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛;當(dāng)歸補(bǔ)血活血，兼能散寒止痛;威靈仙祛風(fēng)通絡(luò);冰片開(kāi)竅通絡(luò)，“能透骨熱”，“亦能生肌止痛”(《醫(yī)林纂要》)，以上共為佐藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎通絡(luò)，續(xù)筋強(qiáng)骨，祛風(fēng)活血之功，起到鎮(zhèn)痛、抗炎和消除瘀血腫脹的作用，阻斷骨性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)展過(guò)程。

從本研究的結(jié)果可以觀察到，模型組關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1 mRNA表達(dá)含量較正常組明顯升高，提示骨性關(guān)節(jié)炎骨節(jié)軟骨中MMP－1 mRNA表達(dá)量增高，TIMP－1 mRNA的表達(dá)量含量低，也許是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中受多種其他因素調(diào)控，從而導(dǎo)致TIMP－1的含量下降，致使MMP－1與TIMP－1的比例失調(diào)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷。各治療動(dòng)物組經(jīng)過(guò)治療后關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1 mRNA表達(dá)含量較模型組均有不同程度的降低，說(shuō)明各組治療藥物治療過(guò)程中都對(duì)關(guān)節(jié)軟骨退變的干預(yù)起到了一定的作用，其中，中藥超微粉組MMP－1 mRNA、TIMP－1 mRNA表達(dá)量與其他各組比較有差異，表明了本藥物對(duì)干預(yù)關(guān)節(jié)軟骨退變有著良好的效果。通過(guò)本研究可以預(yù)想，將調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1與TIMP－1比例關(guān)系作為治療骨性關(guān)節(jié)炎的途徑，通過(guò)干預(yù)MMP－1的上游傳導(dǎo)通路，抑制其合成，同時(shí)通過(guò)其他方式促使TIMP－1合成，最終達(dá)到預(yù)防和治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎作用。

［1］吳迪，崔明，陳云霞，等.獨(dú)活寄生湯加減治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(2):114 －115.

［2］Hulth Jn，Barrach HJ，Chichester CO.Articular collagen degradation in the Hulth － Telhag model of osteoarthritis［J］.Osteoarthr Cartil，1999，7(6):539－547.