王 昆

(佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

從世界范圍來說,白內(nèi)障(Cataract)是可致盲性眼病中最常見的一種[1]。牛磺酸熊脫氧膽酸具有免疫調(diào)節(jié),抗氧化和抗凋亡等多種藥理作用。本實驗觀察 TUDCA作用于離體氧化損傷晶狀體后的變化,探討 TUDCA對過氧化氫誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

?；撬嵝苊撗跄懰?TUNEL試劑盒,眼科顯微器械,解剖顯微鏡,光學(xué)顯微鏡

1.2 方法

頸椎脫臼法處死大鼠后取眼球,75%酒精沖洗數(shù)秒后,用含 32萬 u/L慶大霉素的 PBS溶夜和含 80萬 u/L青霉素、100萬 u/L鏈霉素的 PBS溶液各沖洗 10min。在手術(shù)顯微鏡下由后極部剪開鞏膜,取出晶狀體,放入含 5萬 u/L青霉素和 5萬 u/L鏈霉素的培養(yǎng)基中,在 37℃的 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h,每 12小時更換一次培養(yǎng)液,棄去混濁晶狀體,留取透明晶狀體以供實驗用。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。采用隨機(jī)數(shù)字表法將上述透明晶狀體隨機(jī)分為以下 5組,每組10個。 A組即空白對照組(將篩選后的透明晶狀體置于含10%胎牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)液 2mL的 24孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 l個晶狀體,置入 37℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每 6小時更換 1次培養(yǎng)液,培養(yǎng) 24h)。 B組為 H2O2處理組(在 A組的基礎(chǔ)上再加入 3% H2O24.5μL,使其終濃度為 2mmol/mL)。 C組為 TUDCA1實驗組 (在 B組的基礎(chǔ)上加入濃度為1.0mmol/L的 TUDCA)。 D組為 TUDCA2實驗組(在 B組的基礎(chǔ)上加入濃度為 2.0mmol/L的 TUDCA)。E組為TUDCA3實驗組(在 B組的基礎(chǔ)上加入濃度為 3.0mmol/L的 TUDCA)。培養(yǎng) 24h后,制作組織病理切片,用 TUNEL法檢測晶狀體上皮細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

在 400倍光鏡下觀察每個 TUNEL染色標(biāo)本,每個標(biāo)本都計數(shù) 5個視野的全部細(xì)胞及凋亡細(xì)胞數(shù),計算凋亡細(xì)胞所占百分比即為晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕色或褐色,而正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)色。對照組晶狀體上皮細(xì)胞排列緊密,染色均勻,絕大多數(shù)細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,無明顯的凋亡細(xì)胞。H2O2組晶狀體上皮細(xì)胞大小欠均勻,絕大多數(shù)細(xì)胞核呈棕黃色著染,核固縮,染色質(zhì)聚集成團(tuán),可見大量凋亡細(xì)胞。 TUDCA各組晶狀體上皮細(xì)胞輕度縮小變形,可見部分細(xì)胞核呈棕黃色著染,但比 H2O2組減少。經(jīng)方差分析,各實驗組之間兩兩比較均有顯著性差異(P ＜0.05)。測得實驗各組的凋亡率見表1。

表1 培養(yǎng) 24h各組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率(±s,n=10)

表1 培養(yǎng) 24h各組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率(±s,n=10)

組別 晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率(%)對照組 5.11±0.97 H2O2組 88.64± 4.24 T UDCA1組 69.73± 2.96 T UDCA2組 36.52± 2.41 T UDCA3組 48.31± 3.82

圖 1 各組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡情況(TUN EL×400)

3 討論

白內(nèi)障占盲人總數(shù)的 47%,其中老年性白內(nèi)障是最為常見的類型[2],在我國 50～ 60歲的老年人發(fā)病率為 60%～70%,大于 70歲者達(dá) 80%,大于 80歲者接近 100%[3]。隨著人口逐漸趨于老齡化發(fā)展,患老年性白內(nèi)障的人還會有增無減。白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理頗為復(fù)雜,普遍認(rèn)為自由基引起的氧化損傷與其發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),LECs凋亡可能是白內(nèi)障形成的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)(先天性白內(nèi)障除外)[4]。 H2O2可使細(xì)胞氧化還原反應(yīng)位點向著氧化型方向發(fā)展,細(xì)胞膜功能障礙,DN A結(jié)構(gòu)破壞,鈣離子泵失調(diào),細(xì)胞內(nèi)高鈣激活細(xì)胞凋亡程序使晶狀體上皮細(xì)胞明顯減少,晶狀體滲透壓失衡嚴(yán)重影響晶狀體纖維的透明性和完整性,同時由于晶狀體上皮細(xì)胞不完整,使細(xì)胞骨架降解,蛋白聚集,膜通透性增加水和電解質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),引起核和皮質(zhì)混濁白內(nèi)障形成。

TUDCA是一種親水性的結(jié)合型次級膽汁酸,正常生理狀態(tài)下 ,人體內(nèi)源性 TUDCA的水平很低,它是 UDCA的衍生物,其化學(xué)名稱為 3a,7 β-二羥基膽烷酰-N-?；撬?,是由熊脫氧膽酸與?；撬岬陌被g縮水而成的結(jié)合型天然膽汁酸,廣泛存在于人和動物膽汁中,常常用于膽汁淤積綜合征的膽酸替代治療,其機(jī)制主要是穩(wěn)定線粒體膜、阻止細(xì)胞色素 C釋放、阻止 Caspase-3、Caspase-9活化、激活 Ca2+介導(dǎo)的 PKC、MAPK和 PI3K途徑等[5]。體內(nèi)外的研究顯示,TUDCA比 UDCA對細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)。TUDCA的藥理用途廣泛,主要是保護(hù)肝細(xì)胞,促進(jìn)膽汁酸轉(zhuǎn)運和分泌[6],拮抗疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒作用 ,抗炎作用,抗氧化作用,清除自由基,還可以通過調(diào)控細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑減少細(xì)胞的程序化死亡,TUDCA對多種細(xì)胞和組織都有保護(hù)作用,其抗凋亡性質(zhì)具有廣泛性,提示 TUDCA不但可以用于肝細(xì)胞凋亡相關(guān)性疾病的治療,而且還可以用于治療與凋亡相關(guān)的其他疾病。本實驗用 H2O2誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障快速形成,結(jié)果顯示,不同 TUDCA濃度組晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡率均低于過氧化氫組(P＜0.05),提示 TUDCA能降低晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡率,從而抑制離體大鼠氧化損傷白內(nèi)障的發(fā)展。從晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率結(jié)果中還可以看出,TUDCA2組對抗晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng),TUDCA3組反而降低,由此可見,2.0mmol/L的 TUDCA可能是理想的有效濃度。在不遠(yuǎn)的將來 TUDCA有可能成為新的治療白內(nèi)障藥物。但是,TUDCA應(yīng)用于體外培養(yǎng)的動物模型與應(yīng)用于活體的白內(nèi)障患者作用是否相同,毒副作用及具體的作用機(jī)制等問題都需要進(jìn)一步的研究。

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[3] 陶丹,王雪梅,雷霍.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中hT ERT的活性表達(dá) [J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,7(28):19-20

[4] 李春麗,魯建華,張文芳.紫外線對大鼠晶狀體泛素 mRNA表達(dá)水平的影響 [J].眼外傷職業(yè)眼病雜志(附眼科手術(shù)),2009,31(6):405-407

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