蘇連澍，張 政，王廣舜，徐向英，趙寶泉

糖皮質(zhì)激素主要由腎上腺皮質(zhì)合成和分泌，具有參與機(jī)體的應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、抵御病原體侵入和抗炎等多方面的作用。糖皮質(zhì)激素是臨床廣泛應(yīng)用的藥物，在骨科領(lǐng)域用于風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、滑囊炎等疾病的局部封閉治療。由于操作簡單、見效快，臨床應(yīng)用十分廣泛。許多臨床醫(yī)生已經(jīng)注意到，局部激素注射可以引起肌肉損傷及骨骼肌萎縮等副作用，但其相關(guān)的基礎(chǔ)研究報(bào)道甚少。本文從局部激素注射對肌肉組織影響的實(shí)驗(yàn)研究入手，從顯微和超微結(jié)構(gòu)的水平研究激素對局部肌肉組織的影響，探討骨骼肌萎縮的發(fā)生機(jī)制，為糖皮質(zhì)激素的臨床廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 清潔級健康成年新西蘭大耳白兔24只，雌雄不限，4～6月齡（天津利居生物技術(shù)公司），體質(zhì)量2.5～3.0 kg，單籠飼養(yǎng)，保持動(dòng)物室環(huán)境干燥、通風(fēng)、衛(wèi)生，氣溫保持于15～25℃，給予常規(guī)實(shí)驗(yàn)室飲食。

1.2 試劑及儀器 曲安奈德注射液為昆明積大制藥有限公司生產(chǎn)，批號070208，蘇木素、伊紅購自Sigma公司，Olympus BX-41型顯微鏡及數(shù)碼采集系統(tǒng)為日本奧林帕斯公司產(chǎn)品，Image-ProPlus 5.1圖像分析系統(tǒng)為美國Media Cybernetics公司產(chǎn)品，透射電鏡觀察由天津市第三中心醫(yī)院電鏡室協(xié)助完成。

1.3 動(dòng)物模型建立 大耳白兔24只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組。每只動(dòng)物進(jìn)行自身空白對照，以一側(cè)臀肌做肌注側(cè)，對側(cè)臀肌為對照側(cè)。精確稱重后，實(shí)驗(yàn)組臀肌注射曲安奈德1mg/kg，定點(diǎn)注射，固定深度，每2周1次，共注射3次。對照組臀肌注射等量生理鹽水。單籠飼養(yǎng)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室飲食。

1.4 取材 實(shí)驗(yàn)6周后常規(guī)靜脈氣栓法處死動(dòng)物，取封閉部位肌肉組織及對照側(cè)肌肉組織，大小分別為1cm×1cm×0.5cm及1cm×1cm×3cm大小，分別放入10%中性福爾馬林固定液及pH7.4的4%戊二醛固定液中固定。

1.5 HE染色及觀察 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h后，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。將蠟塊切成5～7 μm厚的組織薄片，進(jìn)行HE染色。在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察。用Image-ProPlus 5.1圖像分析系統(tǒng)，測得單位面積內(nèi)肌細(xì)胞最大直徑及肌細(xì)胞數(shù)量。

1.6 電鏡標(biāo)本觀察 標(biāo)本在4℃下經(jīng)4%戊二醛電鏡固定液中浸泡4 h后，用二甲砷酸緩沖液充分洗滌，1%鋨酸溶液后固定,梯度乙醇脫水,環(huán)氧樹脂包埋修整后切片,切片厚度500～600 nm，鈾鉛染色，順序經(jīng)2550 X、6600 X和9900 X透射電鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）記錄，兩樣本之間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。結(jié)果滿足方差齊性，采用兩組獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色組織病理學(xué)改變 實(shí)驗(yàn)組肌注側(cè):骨骼肌細(xì)胞呈紅色，其間可見血管和神經(jīng)分布?？v切的骨骼肌細(xì)胞呈紅色帶狀，可見多個(gè)細(xì)胞核，橢圓形，呈紫藍(lán)色，位于肌膜下方?？梢娒靼迪嚅g的周期性橫紋，大量紅染的肌原纖維沿肌細(xì)胞長軸排列且橫紋排列紊亂，部分明暗帶有破壞。橫切的骨骼肌纖維呈大小相近的紅色塊狀斷面，斷面最大直徑明顯減小。單位面積下肌細(xì)胞數(shù)量增加。胞核圓形，染紫藍(lán)色，位于細(xì)胞周邊，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的紅色肌原纖維。肌原纖維間含有大量線粒體、糖原以及少量脂滴。肌細(xì)胞內(nèi)并可見空泡樣變（圖1、圖2）。實(shí)驗(yàn)組對照側(cè):縱切的骨骼肌細(xì)胞呈紅色帶狀可見多個(gè)細(xì)胞核，橢圓形，染紫藍(lán)色，位于肌膜下方，可見明暗相間的周期性橫紋，染紅色的肌原纖維沿肌細(xì)胞長軸排列且橫紋排列紊亂，部分明暗帶有破壞。橫切的骨骼肌纖維呈大小相近的紅色塊狀斷面，斷面最大直徑明顯減小。單位面積下肌細(xì)胞數(shù)量增加。肌細(xì)胞內(nèi)并可見空泡樣變。與肌注側(cè)無明顯差別（圖3、圖4）。

圖1 部分肌原纖維明暗帶消失（HE×400）

圖2 肌細(xì)胞內(nèi)可見空泡樣變性（HE×200）

圖3 肌細(xì)胞內(nèi)可見空泡樣變性（HE×400）

圖4 可見肌原纖維排列紊亂（HE×200）

對照組肌注側(cè):骨骼肌細(xì)胞紅色，其間可見血管和神經(jīng)分布?？v切的骨骼肌細(xì)胞呈紅色帶狀可見多個(gè)細(xì)胞核，橢圓形，染紫藍(lán)色，位于肌膜下方，可見明暗相間的周期性橫紋，染紅色的肌原纖維沿肌細(xì)胞長軸排列有序，無明暗帶破壞。橫切的骨骼肌纖維呈大小相近的紅色塊狀斷面，斷面最大直徑無減小。胞核圓形，染紫藍(lán)色，位于細(xì)胞周邊，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的紅色肌原纖維。肌原纖維間含有大量線粒體、糖原以及少量脂滴。肌細(xì)胞間并未見空泡樣變（圖5）。對照組對照側(cè):與肌注側(cè)無明顯差別。

2.2 電鏡觀察肌肉組織病理學(xué)改變 實(shí)驗(yàn)組肌注側(cè):I型肌原纖維結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)均勻，形態(tài)正常，排列整齊有序，可見變形的線粒體及散在的糖原及脂質(zhì)體，明帶略增寬。低倍觀可見II型肌纖維電子密度明顯高于I型肌原纖維，且II型肌纖維自身電子密度不均，排列扭曲，肌節(jié)紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，肌膜溶解或融合，間質(zhì)細(xì)胞變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核間隙增寬（圖6、圖7）。實(shí)驗(yàn)組對照側(cè):I型肌原纖維結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)均勻，形態(tài)正常，排列整齊有序，可見變形的線粒體及散在的糖原及脂質(zhì)體，明帶略增寬。低倍觀可見II型肌纖維電子密度明顯高于I型肌原纖維，且II型肌纖維自身電子密度不均，排列扭曲，肌節(jié)紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，肌膜溶解或融合，間質(zhì)細(xì)胞變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核間隙增寬。與肌注側(cè)無明顯差別。

對照組肌注側(cè):I型肌原纖維排列有序，肌節(jié)各帶清晰，內(nèi)含豐富的糖原及少量線粒體。II型肌纖維平行排列，肌節(jié)清晰，糖原豐富，肌質(zhì)管和肌膜局部清晰。I型與II型肌纖維電子密度均勻，相等。對照組對照側(cè):I型肌原纖維排列有序，肌節(jié)各帶清晰，內(nèi)含豐富的糖原及少量線粒體。II型肌纖維平行排列，肌節(jié)清晰，糖原豐富，肌質(zhì)管和肌膜局部清晰。I型與II型肌纖維電子密度均勻、相等。與肌注側(cè)無明顯差別（圖8）。

圖5 可見肌原纖維明暗帶（HE×400）

圖6 左側(cè)為嚴(yán)重?fù)p傷的Ⅱ型肌原纖維，肌節(jié)消失，線粒體腫脹，肌質(zhì)管擴(kuò)張，肌絲紊亂無序，右側(cè)為Ⅰ型肌原纖維，未見明顯異常

圖7 Ⅱ型肌原纖維的電子密度明顯高于相鄰的Ⅰ型肌原纖維

圖8 Ⅱ型肌原纖維排列整齊，肌節(jié)清晰糖原豐富，肌質(zhì)管和肌膜均清晰

2.3 單位目鏡下肌細(xì)胞數(shù)目 實(shí)驗(yàn)組臀部肌肉單位目鏡下肌細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01；對照組與實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)肌注側(cè)與對照側(cè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組兔肌細(xì)胞數(shù)比較(n=12，)

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組兔肌細(xì)胞數(shù)比較(n=12，)

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別對照組實(shí)驗(yàn)組肌注側(cè)19.66±3.2832.57±6.20*對照側(cè)20.50±4.8530.69±5.07*

2.4 最大肌細(xì)胞直徑 實(shí)驗(yàn)組臀部肌肉最大肌細(xì)胞直徑與對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01；對照組與實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)肌注側(cè)與對照側(cè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組肌細(xì)胞最大直徑測量結(jié)果比較 (n=12，μm，)

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組肌細(xì)胞最大直徑測量結(jié)果比較 (n=12，μm，)

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別對照組實(shí)驗(yàn)組肌注側(cè)41.39±6.2631.28±6.13*對照側(cè)40.92±5.6333.87±4.91*

3 討論

糖皮質(zhì)激素類藥物是一類被廣泛應(yīng)用在關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、滑囊炎等局部封閉治療的藥物，其主要藥理作用包括調(diào)節(jié)糖、脂肪、蛋白代謝、抗炎、免疫抑制、抗休克、抗毒素等。以往在用于一些慢性炎性和自身免疫性疾病的治療過程中，人們發(fā)現(xiàn)長期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后患者骨骼肌明顯萎縮，但其作用機(jī)制尚不完全清楚，可能與骨骼肌蛋白分解代謝增加和蛋白合成代謝減少有關(guān)。關(guān)于胰島素樣生長因子-1阻止糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌萎縮的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[1]，受影響骨骼肌組織中胰島素樣生長因子-1減少，通過增加局部肌肉組織的胰島素樣生長因子-1，可防止糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮。糖皮質(zhì)激素和肌肉組織分解代謝的關(guān)系研究顯示[2]，泛素蛋白酶系統(tǒng)在皮質(zhì)類固醇激素對骨骼肌的分解代謝中起重要作用。通過丙氨酰-谷氨酸鹽阻止糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的肌肉萎縮研究中顯示[3]，糖皮質(zhì)激素主要通過影響氨基酸代謝中谷氨酸的合成來影響骨骼肌的合成。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)肌萎縮和基因表達(dá)有關(guān)，糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-486可顯著減輕骨骼肌萎縮。一方面，糖皮質(zhì)激素作用于蛋白質(zhì)合成的限速環(huán)節(jié)-核糖體起始復(fù)合物。激素-受體復(fù)合物與DNA上相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合后降低了RNA的合成率，使總RNA量和核糖體RNA量減少，同時(shí)降低起始因子的活性，使蛋白質(zhì)的翻譯效率降低；另一方面，糖皮質(zhì)激素作用于肌細(xì)胞中的泛素蛋白酶系統(tǒng)、堿性肌原纖維蛋白酶、溶酶體酶、鈣蛋白酶系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。萎縮肌肉肌纖維變細(xì)，橫截面積減小，無氧酵解型肌纖維較有氧氧化型肌纖維更容易受糖皮質(zhì)激素的影響。泛素蛋白酶系統(tǒng)在皮質(zhì)類固醇激素對骨骼肌的分解代謝中起重要作用，在蛋白質(zhì)降解過程中，泛素首先與蛋白質(zhì)底物共價(jià)結(jié)合，并作為蛋白降解的啟動(dòng)信號，后啟動(dòng)多步驟的降解過程，泛素氨基酸末端的甘氨酸與蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的8-氨基共價(jià)結(jié)合后，由一個(gè)蛋白水解復(fù)合體對蛋白質(zhì)進(jìn)行迅速水解[4]。糖皮質(zhì)類固醇是多種病理?xiàng)l件下介導(dǎo)骨骼肌蛋白質(zhì)分解的主要因素，禁食或酸中毒大鼠在事先切除腎上腺的條件下骨骼肌蛋白分解并不增加，而一旦在飲水中加入皮質(zhì)類固醇，骨骼肌蛋白質(zhì)分解又增加。皮下注射地塞米松后大鼠伸趾長肌蛋白分解率顯著升高，而且與地塞米松的劑量相關(guān)，伴有ATP依賴的泛素系統(tǒng)上調(diào)[5]，表明糖皮質(zhì)激素通過其受體在基因水平增強(qiáng)泛素系統(tǒng)活性導(dǎo)致骨骼肌蛋白高分解代謝。糖皮質(zhì)激素主要通過其與受體(GR)結(jié)合而發(fā)揮不同作用。然而，這種多效性作用也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，引起免疫抑制，高血壓，抑制傷口修復(fù)，骨質(zhì)疏松，肌肉萎縮以及代謝紊亂等。

骨骼肌纖維的分為I型纖維（紅肌或慢縮肌），其較少而細(xì)，含肌紅蛋白多，周圍毛細(xì)血管豐富呈紅色，故稱紅肌，反應(yīng)速度慢，收縮力量較小，但持續(xù)時(shí)間長、不易疲勞，也稱慢肌。II型纖維（白肌或快收縮?。┝慷喽?，脂類物質(zhì)、三磷酸腺苷和磷酸肌酸等含量比紅肌多。I型纖維為有氧氧化型纖維，收縮速度慢，不易疲勞，對維持姿勢起重要作用。II型纖維為無氧酵解型纖維，收縮速度快，力量大，但不能持久，易疲勞。通過氟美松對正常大鼠膈肌的影響研究中發(fā)現(xiàn)[6]，糖皮質(zhì)激素對大鼠膈肌的最大張力無明顯影響，但其耐力降低，易誘發(fā)疲勞。由此不難得出氟美松主要影響膈?、蛐图±w維，對Ⅰ型肌纖維無明顯影響，這與本研究的結(jié)果相同。在糖皮質(zhì)激素對大鼠膈肌形態(tài)及功能作用的實(shí)驗(yàn)觀察中，肌肉組織中的肌纖維比例沒有影響，但是Ⅱ型纖維的橫截面積明顯變小，I型纖維改變較小。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)肌萎縮中不同肌纖維類型的改變研究結(jié)果顯示[7]，萎縮肌肉肌纖維變細(xì)，橫截面積減小，無氧酵解型肌纖維較有氧氧化型肌纖維更容易受糖皮質(zhì)激素的影響。在對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)兔咬肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，曲安奈德有肯定的誘導(dǎo)肌萎縮的作用，主要為Ⅱ型肌纖維萎縮，對I型肌纖維無明顯影響。這也與本研究得出的結(jié)論相同。但是我們觀察到，糖皮質(zhì)激素注射只對注射局部產(chǎn)生影響，對對照側(cè)未產(chǎn)生明顯影響，考慮這可能與糖皮質(zhì)激素的用藥量和用藥時(shí)間有關(guān)。

糖皮質(zhì)激素引起骨骼肌萎縮可能是通過多種途徑和多種因素對細(xì)胞組織蛋白質(zhì)和氨基酸代謝作用的結(jié)果。糖皮質(zhì)激素局部封閉對全身及局部肌肉組織均產(chǎn)生影響，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示局部封閉治療可使肌肉細(xì)胞最大直徑的減小，細(xì)胞數(shù)目減少，且影響II型肌原纖維的分布與排列，應(yīng)可能是引起局部肌肉萎縮的主要原因之一。

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