張其安，王 娟，戴建曉，杜培粉，王素輕，盧德梅，楊少波,*

(1.山東華康蜂業(yè)有限公司，山東 日照 276500；2.山東水利職業(yè)學(xué)院，山東 日照 276826；3.咸陽(yáng)健康蜂業(yè)有限公司，陜西 咸陽(yáng) 713400)

高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定蜂蜜中的果糖、葡萄糖和麥芽糖

張其安1，王 娟2，戴建曉1，杜培粉1，王素輕1，盧德梅3，楊少波1,*

(1.山東華康蜂業(yè)有限公司，山東 日照 276500；2.山東水利職業(yè)學(xué)院，山東 日照 276826；3.咸陽(yáng)健康蜂業(yè)有限公司，陜西 咸陽(yáng) 713400)

建立反相離子對(duì)色譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中果糖、葡萄糖、麥芽糖含量的方法。樣品經(jīng)對(duì)氨基苯甲酸衍生化后，采用ODS柱，以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)∶乙腈=95∶5為流動(dòng)相，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，果糖、葡萄糖、麥芽糖的檢出限分別為210、96、240μg/kg，線性范圍分別為130～140、52～98、154～98mg/kg，在其線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r≥0.9988；該方法加標(biāo)回收率在98.2%～101.2%之間，RSD在3.4%～5.4%之間。該方法靈敏、結(jié)果可靠。

高效液相色譜；熒光檢測(cè)；蜂蜜；還原糖

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水貯存至成熟而成的天然甜物質(zhì)[1-2]。蜂蜜中含有超過(guò)180種活性物質(zhì)，其主要成分為果糖和葡萄糖及4%～5%的低聚果糖，另外蜂蜜中還含有豐富的氨基酸、維生素、活性酶、類黃酮、多酚類、類胡蘿卜素等活性物質(zhì)及多種礦物質(zhì)[3]。蜂蜜具有抗氧化、抗菌、加速創(chuàng)傷修復(fù)、增強(qiáng)免疫力等多種生理活性[4-6]，因而蜂蜜不但被作為一種直接有效的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充來(lái)源，而且被應(yīng)用于治療肝炎、癌癥、傷口感染、便秘以及改善胃腸功能、提高機(jī)體免疫力等[7-8]。近年來(lái)，蜂蜜作為一種藥食兩用的天然保健品，受到越來(lái)越多的青睞。

我國(guó)是養(yǎng)蜂及蜂蜜出口大國(guó)，20世紀(jì)90年代我國(guó)蜂蜜出口量占世界年貿(mào)易量的40%。然而，蜂蜜是一種極易摻假的食品，近年來(lái)由于摻假等質(zhì)量問(wèn)題，使我國(guó)蜂蜜產(chǎn)品的信譽(yù)越來(lái)越低，出口量逐年下降[9]。為了規(guī)范蜂蜜市場(chǎng)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)于2005年10月26日發(fā)布了GB 18796—2005《蜂蜜》國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，并規(guī)定自2006年3月1日起實(shí)施。GB 18796—2005規(guī)定蜂蜜中果糖和葡萄糖含量應(yīng)大于等于60%，而歐盟、日本等蜂蜜進(jìn)口國(guó)還規(guī)定了蜂蜜中還原糖含量及果葡比等參數(shù)。因此，必須建立一系列蜂蜜中還原糖的測(cè)定方法，既可以保護(hù)消費(fèi)者利益，又對(duì)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

目前，關(guān)于蜂蜜中還原糖測(cè)定的方法主要有滴定法、旋光法、薄層色譜、高效液相色譜法、離子色譜脈沖安培法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效毛細(xì)管電泳法、核磁共振法等[10-17]。但是傳統(tǒng)的滴定法、薄層色譜法、旋光度法操作繁瑣而且準(zhǔn)確度不高。高效液相色譜法采用示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，靈敏度較低，且受溫度、流動(dòng)相影響大。離子色譜脈沖安培法用于單糖、二糖、小分子寡糖的測(cè)定，具有靈敏度高、選擇性好、不用衍生、操作簡(jiǎn)便等有點(diǎn)。但是，離子色譜對(duì)試劑、進(jìn)樣樣品要求較高，樣品前處理步驟要求嚴(yán)格，而且需要專門(mén)的離子色譜和脈沖安培檢測(cè)器[18]。毛細(xì)管電泳、氣質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等方法設(shè)備昂貴，不易在國(guó)內(nèi)中小型蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)普及。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，旨在建立一種同時(shí)測(cè)定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、麥芽糖的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

對(duì)氨基苯甲酸 上?；瘜W(xué)試劑供應(yīng)站試劑廠；氰基硼氫化鈉 德國(guó)Emerck公司； 果糖(99%)、葡萄糖(99%)、麥芽糖(99%) 上?；瘜W(xué)試劑公司；甲醇、乙腈、冰乙酸(均為色譜純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；磷酸氫二鈉、磷酸(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；超純水。

LC-10AVP Plus高效液相色譜儀(配有RF-10AXL熒光檢測(cè)器、DGU-20A3在線脫氣機(jī)、LC-20ATXL泵、CTO-10ASVP柱溫箱、手動(dòng)進(jìn)樣器、LC-Solution數(shù)據(jù)處理軟件)和AUY220型分析天平 日本島津公司；DZKW-D-2型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

1.2.1 果糖、葡萄糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別準(zhǔn)確稱取3g果糖、2.4g葡萄糖、0.24g麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于3個(gè)100mL的容量瓶中，用超純水定容，4℃保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別吸取1.2.1節(jié)中各單糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL，充分混勻，待衍生化。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2g蜂蜜置于100mL的燒杯中，加入30mL超純水，使樣品完全溶解，轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中，然后用超純水潤(rùn)洗定容，混勻，待衍生化。

1.4 衍生劑的配制

稱取0.7g對(duì)氨基苯甲酸、1g冰乙酸、0.1g氰基硼氫化鈉于具塞試管中，以10mL甲醇定容，4℃保存。

1.5 衍生化反應(yīng)條件

取50μL單糖標(biāo)準(zhǔn)液、混合標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液，加入100μL衍生劑，充分混勻，于70℃恒溫水浴中衍生[19]，60min后，冷卻定容至2mL。分別稀釋不同的倍數(shù)，以0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.6 色譜條件

色譜柱：Sinochrom ODS-BP柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)∶乙腈=95∶5；流速：0.5mL/min；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：λex為313nm，λex為358nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

圖1 衍生物的峰面積隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線Fig.1 Effect of reaction time on derivative peak area

從圖1可以看出，在50min內(nèi)葡萄糖和麥芽糖衍生化產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到最高，50min后葡萄糖和麥芽糖衍生化產(chǎn)物產(chǎn)率開(kāi)始降低，而果糖衍生化產(chǎn)物產(chǎn)率在60min后達(dá)到最高值。由此可見(jiàn)果糖對(duì)衍生化試劑對(duì)氨基苯甲酸反應(yīng)不敏感，產(chǎn)物產(chǎn)率較低，為了提高果糖衍生化產(chǎn)物產(chǎn)率，從而增加果糖測(cè)定的靈敏度。采用文獻(xiàn)[19]中衍生化反應(yīng)溫度，本研究選擇反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間60min為衍生化反應(yīng)條件。

2.2 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

由于單糖為高度親水性化合物，在C18柱上保留時(shí)間較短且不能得到較好的分離，高效液相色譜法分析糖類物質(zhì)時(shí)一般需專用的氨基柱。通過(guò)衍生化可以改變單糖的局部結(jié)構(gòu)，有助于單糖在C18柱上保留和分離。實(shí)驗(yàn)中考察了Sinochrom ODS-BP柱、SHIMADZU VP-ODS C18柱(4.6mm×150mm，5μm)為分離色譜柱對(duì)蜂蜜中單糖的分離效果。結(jié)果表明，Sinochrom ODS-BP柱能將3中還原糖很好的分離，這可能是因?yàn)镾inochrom ODSBP柱更適合分離極性較強(qiáng)的化合物，因此選擇Sinochrom ODS-BP柱為該方法的分離色譜柱。

圖2 磷酸鹽緩沖液-乙腈(90∶10)作為流動(dòng)相時(shí)混合標(biāo)樣(A)和蜂蜜中還原糖(B)色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide standards and reducing sugars in honey using 0.1 mol/L phosphate buffer solution-acetonitrile at 90∶10 as mobile phase

圖3 磷酸鹽緩沖液-乙腈(95∶5)作為流動(dòng)相時(shí)混合標(biāo)樣(A)和蜂蜜中還原糖(B)色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide standards and reducing sugars in honey using 0.1 mol/L phosphate buffer solution-acetonitrile at 95∶5 as mobile phase

以含有20mmol/L四丁基硫酸氫銨的磷酸鹽緩沖液-乙腈體系作為流動(dòng)相，考察不同配比磷酸鹽緩沖液-乙腈體系對(duì)單糖的分離情況。以磷酸鹽緩沖液-乙腈(90∶10)作為流動(dòng)相時(shí)混合標(biāo)樣中各單糖組分得到較好的分離，但是蜂蜜中果糖色譜峰前有一雜峰，且分離效果不好，結(jié)果見(jiàn)圖2。因此，適當(dāng)減少流動(dòng)相中乙腈的含量，以磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)-乙腈(95∶5)作為流動(dòng)相時(shí)混合標(biāo)樣和蜂蜜中各單糖組分均得到較好的分離，且峰形對(duì)稱，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

將1.5節(jié)中衍生化反應(yīng)后單糖的混合標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成一些列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在以上優(yōu)化后的高效液相條件下分析。以標(biāo)準(zhǔn)峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度進(jìn)行線性回歸，得到3種單糖的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。同時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋法測(cè)得3種單糖的檢出限(以RSN=3計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及線性范圍Table 1 Regression equations, correlation coefficients, detection limits and linear ranges

2.4 方法的精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化好的色譜條件下，分別在蜂蜜測(cè)試樣品中添加標(biāo)樣，進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，其測(cè)試回收率均在98.2%～101.2%之間，重復(fù)測(cè)定7次，計(jì)算各組分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.4%～5.4%之間(表2)。結(jié)果表明，該方法精密度較高，能夠滿足實(shí)際樣品的測(cè)定。

表2 方法加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)(n=7)Table 2 Spike recoveries and precise RSDs of fructose, glucose, and maltose in honey (n=7)

2.5 蜂蜜中單糖含量測(cè)定結(jié)果

圖4 洋槐蜜中還原糖色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of reducing sugars in robinia honey

以優(yōu)化條件對(duì)5種蜂蜜樣品進(jìn)行分析，分離效果較好，結(jié)果如圖4(以洋槐蜜為例)所示。將樣品測(cè)定的單糖峰面積代入上述回歸方程，計(jì)算出各種單糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蜂蜜樣品中糖含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Fructose, glucose, and maltose contents in real honey samples

3 結(jié) 論

熒光檢測(cè)器具有靈敏度高、選擇性高、線性范圍寬、受外界條件影響小等優(yōu)點(diǎn)，因而在藥物和生化分析中起著不可替代的作用。但是單糖本身并不帶有熒光基團(tuán)，而且在C18柱上保留時(shí)間短，不容易分離。對(duì)單糖進(jìn)行衍生化處理后，可以使其帶上熒光基團(tuán)，便于熒光檢測(cè)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)衍生化改變了單糖分子的局部結(jié)構(gòu)，使其在C18柱上獲得較好的保留和分離。本實(shí)驗(yàn)以對(duì)氨基苯甲酸為衍生化試劑對(duì)蜂蜜中的還原糖進(jìn)行衍生化處理后，以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)∶乙腈=95∶5為流動(dòng)相，熒光檢測(cè)器測(cè)定蜂蜜中的3種還原糖，檢出限分別為果糖210μg/kg、葡萄糖96μg/kg、麥芽糖240μg/kg。本方法的局限性：由于對(duì)氨基苯甲酸只能與還原糖反應(yīng)，因此本方法不能測(cè)定蜂蜜中的蔗糖等非還原糖。

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Determination of Fructose, Glucose, and Maltose in Honey by HPLC-FLD

ZHANG Qi-an1，WANG Juan2，DAI Jian-xiao1，DU Pei-fen1，WANG Su-qing1，LU De-mei3，YANG Shao-bo1,*
(1. Shandong Huakang Honey Products Co. Ltd., Rizhao 276500, China；2. Shandong Vocational College of Water Conservancy, Rizhao 276826, China；3. Xianyang Jiankang Honey Products Co. Ltd., Xianyang 713400, China )

An ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatographic method was developed to simultaneous determine fructose, glucose, and maltose in honey using p-aminobenzoic acid (p-AMBA) for pre-column derivatization. The chromatographic separation was achieved on an ODS column using a mobile phase made up of 0.1 mol/L phosphate buffer solution (20 mmol/L tetrabutylammoniumhydrogen sulfate, pH 2.5) and acetonitrile (95∶5, V/V). The analytes were detected using a fluorescence detector and quantified by external standard method. The results showed that the detection limits of fructose, glucose and maltose were 210, 96μg/kg and 240μg/kg, respectively, and the linear ranges were 130 -140, 52-98 mg/kg, and 154-98 mg/kg (r ＞ 0.9988). The spike recoveries ranged from 98.2% to 101.2%， with RSDs between 3.4% and 5.4%.

high performance liquid chromatographic；fluorescence detection；honey；reducing sugars

R155.5

A

1002-6630(2011)14-0249-04

2010-09-09

張其安(1966—)，男，會(huì)計(jì)師，本科，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品加工與檢測(cè)。E-mail：sdhkfy@126.com

*通信作者：楊少波(1978—)，男，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品加工與檢測(cè)。E-mail：shboyg@126.com