郭贛林，徐深圳，李文浩，孫穎穎,*，王長(zhǎng)海

(1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港222005；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

球等鞭金藻多糖的微波萃取工藝

郭贛林1,2，徐深圳1，李文浩1，孫穎穎1,2,*，王長(zhǎng)海3

(1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港222005；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

采用微波法，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究pH值、微波功率、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化多糖的微波提取工藝。最后，比較微波提取法和熱水浸提法制備的球等鞭金藻多糖樣品的紅外光譜，并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值、微波功率、萃取溫度和萃取時(shí)間均能顯著影響球等鞭金藻多糖的提取。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，微波法提取球等鞭金藻多糖的最佳工藝為pH9、微波功率600W、萃取溫度90℃、萃取時(shí)間20min。微波提取法和熱水浸提法制備的多糖產(chǎn)率分別為96.8mg/g和47.7mg/g。其中，前者蛋白質(zhì)和多糖含量分別為1.08%和43.6%，后者中蛋白質(zhì)和多糖含量依次為1.18%和22.1%。微波法與熱水浸提法制備的多糖具有相似的紅外光譜，表明微波提取法并不會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)。綜上所述，在球等鞭金藻多糖提取過(guò)程中，微波法明顯優(yōu)于熱水浸提法。

球等鞭金藻；多糖；微波提取法；熱水浸提法；紅外光譜

海洋微藻多糖是海洋微藻的生物活性物質(zhì)之一，海洋微藻的生長(zhǎng)條件和環(huán)境特點(diǎn)決定了其具有一些有別于陸生植物多糖的結(jié)構(gòu)和功能。因此，加快海洋微藻多糖的開(kāi)發(fā)可以彌補(bǔ)陸地植物多糖及海藻多糖藥用特性的不足。然而，相對(duì)于陸地植物和海藻而言，海洋微藻多糖的報(bào)道較少，且主要集中在螺旋藻(Spirulinasp.)[1-4]、紫球藻(Porphyridium cruentum)[5-7]、小球藻(Chlorellasp.)[8-10]和鹽藻(Dunaliella salina)[11]等微藻的抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和提高免疫力等活性研究方面，而較少報(bào)道海洋微藻多糖的提取工藝[7,12-14]。

微波輔助提取(microwave assisted extraction，MAE)是利用微波能的加熱效應(yīng)來(lái)加速溶劑對(duì)固體樣品中目標(biāo)化合物提取的新技術(shù)。研究顯示，這種方法與傳統(tǒng)熱水浸提方法相比具有節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。劉四光等[15]采用MA E法進(jìn)行了自養(yǎng)小球藻(Chlor ella autotrophica)多糖的提取研究，發(fā)現(xiàn)在一定實(shí)驗(yàn)條件下，與傳統(tǒng)熱水浸提法相比微波提取法并不會(huì)破壞自養(yǎng)小球藻多糖結(jié)構(gòu)，且在多糖產(chǎn)率上要優(yōu)于熱水浸提法。在微波輔助提取海水小球藻多糖研究中，鄧永智發(fā)現(xiàn)時(shí)間和溫度對(duì)多糖的提取率有較大的影響[16]。

球等鞭金藻(Isochrysis galbana)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常用的餌料微藻[5]。通過(guò)前期工作，筆者發(fā)現(xiàn)此微藻細(xì)胞內(nèi)含有較高含量的多糖[17]；采用熱水浸提法(hot water immersed，HWI)獲得了其多糖的適合提取工藝：pH8、溫度70℃、時(shí)間180min、液料比15:1(mL/g)[18]。為尋求快速、節(jié)能、高效的提取工藝，在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用MAE法提取多糖，通過(guò)一系列單因素和正交試驗(yàn)，分析pH值、微波功率、溫度以及時(shí)間等因素對(duì)多糖提取的影響，同時(shí)，比較MAE法和HWI法提取的多糖的紅外光譜圖，以確保在不影響多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提下獲得適合于球等鞭金藻多糖的微波提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

球等鞭金藻由中國(guó)海洋大學(xué)提供，置于40L光照平板生物反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)，通氣量2.0L/min，溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度3000 lx，接種密度40×104/mL，f/2培養(yǎng)基[19]。培養(yǎng)10d后，5000×g離心15min，收集藻細(xì)胞，采用冷凍干燥法制備成藻粉。

LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；LG-5型真空冷凍干燥機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；UV-1800型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞麗分析儀器公司；XH-100型微波合成萃取儀 北京祥鵠科技公司。

1.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.4g球等鞭金藻粉，以蒸餾水為提取溶劑，設(shè)定液料比15:1(mL/g)為，分別改變pH值、微波功率、溫度和時(shí)間等因素，分析它們對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響，每個(gè)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。按照上述試驗(yàn)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取后，過(guò)濾，上清液采用3% TCA除蛋白(4℃靜置4 h)。隨后，經(jīng)3倍體積乙醇沉淀，靜置過(guò)夜后，于5000×g離心10min，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，稱量后獲得粗多糖的質(zhì)量。

1.2.1 pH值對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

設(shè)定溫度70℃、時(shí)間30min、微波功率600W，pH值分別為6、7、8、9、1 0、1 1。

1.2.2 微波功率對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

設(shè)定pH8、溫度70℃、時(shí)間30min，微波功率依次為300、400、500、600、700、800W。

1.2.3 萃取溫度對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

設(shè)定pH8、時(shí)間30min、微波功率600W，溫度分別為40、5 0、6 0、7 0、80、9 0℃。

1.2.4 萃取時(shí)間對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

設(shè)定pH8、溫度70℃、微波功率600W，時(shí)間依次為5、10、20、30、40、50min。

1.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步分析pH值、微波功率、溫度和時(shí)間對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響，優(yōu)化多糖的微波提取工藝。最后，用蒽酮比色法[20]測(cè)定粗多糖中總糖含量，通過(guò)計(jì)算獲得粗多糖樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.4 紅外光譜測(cè)定

采用熱水浸提法制備球等鞭金藻多糖樣品，工藝條件為pH8、溫度70℃、時(shí)間180min、液料比15:1。同時(shí)，采用球等鞭金藻多糖的優(yōu)化微波提取工藝制備多糖樣品。采用紅外光譜儀，樣品以KBr壓片，在4000～600cm-1區(qū)間掃描。

1.5 粗多糖的提取率和產(chǎn)率

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

從圖1可以看出，堿性pH值更利于球等鞭金藻多糖的提取。pH值從6增加到10過(guò)程中，多糖提取率隨pH值的增大而增加。在70℃、時(shí)間30min，微波功率600W條件下，于pH10時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值，其數(shù)值顯著(P＜0.05)高于pH6時(shí)的提取率，為pH6時(shí)提取率的4.2倍。當(dāng)pH值繼續(xù)增大為11時(shí)，多糖提取率開(kāi)始顯著(P＜0.05)下降，但仍高于pH6時(shí)的提取率。

上述結(jié)果表明，pH10條件下多糖提取率高于pH6～9條件下多糖提取率。這可能是因?yàn)槲⒃宥嗵侵杏幸徊糠炙嵝远嗵?，它們?huì)隨著提取液堿性的增強(qiáng)而更易被溶出；并且，多糖與蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間可能會(huì)以非共價(jià)鍵形態(tài)結(jié)合在一起，在堿性條件下，蛋白質(zhì)等易被溶解，從而將多糖釋放出來(lái)[7,12,14]。然而，pH值也不能過(guò)高，這是因?yàn)樵跓釅A環(huán)境下有一部分多糖可能被降解，從而導(dǎo)致多糖提取率的下降。在自養(yǎng)小球藻多糖微波提取法研究中，劉四光等[15]認(rèn)為pH值對(duì)自養(yǎng)小球藻多糖提取率的影響主要是由于粗多糖上具有的官能團(tuán)而造成的，也即粗多糖具有的－O－SO3H、－NH2、－CHO和－OH等官能團(tuán)可能受質(zhì)子官能團(tuán)的影響從而影響粗多糖在不同pH值提取溶液中的親水性。

2.1.2 微波功率對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

圖2 微波功率對(duì)球等鞭金藻多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharides from I. galbana

圖2表明，在微波功率300～600W范圍內(nèi)，多糖提取率隨微波功率的增加而明顯增大(P＜0.05)，在600W時(shí)，多糖提取率最大，其值為300W多糖提取率的3倍。當(dāng)微波功率增至800W時(shí)，多糖提取率有所下降，但仍然顯著高于微波功率為300W時(shí)的多糖提取率(P＜0.05)。微波功率300～500W條件下多糖提取率較低的原因可能是由于在功率較低的情況下升溫速度較慢，或溫度未能達(dá)到設(shè)定值從而導(dǎo)致多糖提取率較低。而當(dāng)微波功率高于700W時(shí)，較高的功率可能導(dǎo)致多糖降解從而多糖提取率下降。

2.1.3 萃取溫度對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

圖3 萃取溫度對(duì)球等鞭金藻多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from I. Galbana

由圖3可見(jiàn)，在試驗(yàn)設(shè)定的溫度范圍內(nèi)，多糖提取率隨萃取溫度的升高而顯著(P＜0.05)增大，在90℃時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值，提取率為32%，其值為40℃時(shí)提取率的2.3倍。這表明，高溫條件更利于多糖的提取。

劉四光等[15]采用微波法提取自養(yǎng)小球藻多糖，發(fā)現(xiàn)在70～90℃溫度范圍內(nèi)多糖提取率隨溫度升高增加的幅度變小，故將自養(yǎng)小球藻多糖的提取溫度選定為70℃。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻多糖提取率隨溫度升高而明顯(P＜0.05)增大，90℃時(shí)提取率為70℃時(shí)提取率的1.3倍，因此，將微波法提取球等鞭金藻多糖的溫度選定為90℃。這可能是由于微藻種類不同，從而微藻多糖的微波提取溫度不同。在熱水浸提法提取多糖研究中，孫穎穎等[18]發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻多糖的適宜提取溫度為70℃，當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)多糖提取率開(kāi)始下降。王長(zhǎng)海[9]、鄭維發(fā)等[20]認(rèn)為高溫條件下微藻多糖容易降解。本試驗(yàn)中球等鞭金藻多糖的適宜提取溫度(為90℃)高于70℃，然而，多糖提取率并未下降，這主要是由多糖的提取方法不同而造成。前者研究采用熱水浸提法、時(shí)間4h、pH10，長(zhǎng)時(shí)間處于堿性高溫條件下，多糖出現(xiàn)明顯降解趨勢(shì)；本試驗(yàn)采用微波提取法、時(shí)間30min、pH8，90℃時(shí)多糖還未出現(xiàn)降解或明顯降解現(xiàn)象，故此多糖提取率仍然較高。由于提取溫度直接影響多糖結(jié)構(gòu)，過(guò)高溫度將會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，因此本試驗(yàn)并未將溫度設(shè)定過(guò)高。

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)球等鞭金藻多糖提取的影響

時(shí)間在5～30min范圍內(nèi)，多糖提取率隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)而明顯(P＜0.05)增大，在30min提取率最大。當(dāng)萃取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，多糖提取率開(kāi)始下降，但仍然顯著高于5～20min范圍內(nèi)的多糖提取率(圖4)。結(jié)果表明，在微波浸提法中，延長(zhǎng)提取時(shí)間，有利于球等鞭金藻多糖的充分溶出，從而在一定時(shí)間范圍內(nèi)多糖提取率隨時(shí)間的增加而增大。然而，萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)引起多糖降解，致使多糖提取率有所下降[7,14]。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)球等鞭金藻多糖萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from I. galbana

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化球等鞭金藻多糖的微波提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見(jiàn)表1、2。

表1 多糖萃取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and corresponding results

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 2 Variance analysis for orthogonal array experimental results

通過(guò)直觀分析和方差分析可知，pH值、微波功率、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響順序?yàn)閜H值(微波功率)＞萃取溫度＞萃取時(shí)間。同時(shí)，獲得多糖提取的最佳條件為pH9、微波功率600W、萃取溫度90℃和萃取時(shí)間20min，但正交表中未見(jiàn)此試驗(yàn)組合，因此，采用追加實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，多糖適宜的微波萃取工藝為pH9、微波功率600W、萃取溫度90℃和萃取時(shí)間20min。

2.3 球等鞭金藻多糖樣品的測(cè)定

采用熱水浸提法和微波提取法制備多糖樣品，并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量。結(jié)果表明，前者制備的粗多糖產(chǎn)率為47.7mg/g，樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量分別為1.18%和22.1%；后者制備的粗多糖產(chǎn)率為96.8mg/g，樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量依次為1.08%和43.6%。

圖5 微波提取法(a)與傳統(tǒng)熱水浸提法(b)所得粗多糖的紅外光譜的比較Fig.5 IR spectra of crude polysaccharides extracted by microwaveassisted (a) and hot-water immersion methods (b)

表3 微波提取法與傳統(tǒng)熱水浸提法制備的粗多糖的紅外光譜對(duì)比Table 3 IR spectral data of crude polysaccharides extracted by microwave-assisted and hot-water immersion methods

從圖5和表3可看出，兩種提取方法所得粗多糖的紅外光譜具有比較相似的特征。其中，在3700～3100cm-1和1075～1010cm-1兩處為糖類羥基O－H和C－O的特征吸收峰；在3000～2800cm-1和1550～1200cm-1的吸收峰為C－H的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)；1700～1500cm-1附近的吸收峰為酰氨基C=O的伸縮振動(dòng)，表明兩種多糖中均含有酰氨取代基。另外，在1377cm-1附近有較強(qiáng)的吸收峰，表明兩種粗多糖都含有硫酸取代基；在1057cm-1附近吸收峰表明，所得多糖是一種以半乳糖為構(gòu)架的分子模式[21]。在糖類的環(huán)振動(dòng)吸收區(qū)930～700cm-1，兩種糖在900.08cm-1和900.16cm-1附近的吸收峰是β-吡喃環(huán)Cl－H的變角振動(dòng)。由此可見(jiàn)，微波提取法在一定的條件下不會(huì)對(duì)所得多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

3 結(jié) 論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值、微波功率、溫度和時(shí)間等因素均能顯著影響球等鞭金藻多糖的提取。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定最佳工藝條件為pH 9、微波功率600 W、萃取溫度90℃、萃取時(shí)間20min，采用此提取工藝制備的粗多糖樣品的蛋白質(zhì)和多糖含量分別為1.08%和43.6%。熱水浸提法制備的粗多糖樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量依次為1.18%和22.1%。并且，微波法和熱水浸提法制備的粗多糖產(chǎn)率分別為96.8mg/g和47.7mg/g。兩種提取方法所得多糖在結(jié)構(gòu)上比較相似，含有酰氨基和硫酸基等官能團(tuán)，兩者多糖糖鏈中存在β-吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，且都含有以半乳糖為構(gòu)架的分子模式。這表明微波提取法在一定的條件下不會(huì)對(duì)所得多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。綜上所述，在球等鞭金藻多糖提取過(guò)程中，微波法明顯優(yōu)于熱水浸提法。

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Optimization of Microwave-assisted Extraction of Polysaccharides fromIsochrysis galbana

GUO Gan-lin1,2，XU Shen-zhen1，LI Wen-hao1，SUN Ying-ying1,2,*，WANG Chang-hai3
(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Jiangsu Marine Resources Develepment Research Insititute, Lianyungang 222005, China；3. College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

One-factor-at-a-time method and orthogonal array design were employed to optimize four process conditions for microwave-assisted extraction of polysaccharides fromIsochrysis galbanasuch as pH, microwave power, temperature and extraction time. One-factor-at-a-time experiments showed that each of the four conditions had a marked effect on polysaccharide extraction, and their optimal levels were identified by orthogonal array design to be: pH 9, microwave power of 600 W, extraction temperature of 90 ℃ and extraction time of 20 min. Under these conditions, the extraction rate of crude polysaccharides was 96.8 mg/g compared with 47.7 mg/g for hot water extraction, and the contents of protein and polysaccharides were respectively 1.08% and 43.6% in the crude polysaccharide sample obtained compared with 1.18% and 22.1% for hot water extraction. The crude polysaccharides obtained by both extraction methods revealed similar IR spectra, demonstrating that microwave did not destroy the chemical structures of polysaccharides. In summary, microwave-assisted extraction is greatly superior to hot water extraction.

Isochrysis galbana；polysaccharide；microwave-assisted extraction；hot water immersion extraction；IR spectrum

Q946.3

A

1002-6630(2011)14-0113-05

2010-09-17

江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院開(kāi)放課題(JSIMR09D08)

郭贛林(1977—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)學(xué)。E-mail：guoganlin@163.com

*通信作者：孫穎穎(1978—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊こ獭-mail：syy-999@163.com