趙曉娟，冼燕萍，羅海英，錢 敏，白衛(wèi)東,*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 510110)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測花生油中4種黃曲霉毒素

趙曉娟1，冼燕萍2，羅海英2，錢 敏1，白衛(wèi)東1,*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東 廣州 510110)

建立同時測定花生油中4種黃曲霉毒素(包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)。該方法經(jīng)甲醇-水、三氯甲烷依次提取樣品，以C18柱分離，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液(梯度洗脫)，采用電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitor，MRM)模式檢測。結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.0～20.0μg/kg進(jìn)樣范圍內(nèi)線性良好；用本法測定4種黃曲霉毒素的回收率在70.8%～108.0%(低加標(biāo)水平)、82.4%～104.5%(中和高加標(biāo)水平)之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.7%～9.7%之間。運(yùn)用所建立的方法對市售19種不同品牌和批次的花生油中的黃曲霉毒素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于花生油中4種黃曲霉毒素的定性、定量測定。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)；黃曲霉毒素；花生油；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的次生代謝物[1-2]，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二氫呋喃香豆素的衍生化合物，最為重要的包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黃曲霉毒素M1和M2經(jīng)動物代謝產(chǎn)生并殘留于牛奶及其制品中，黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2易污染多種農(nóng)作物、食品及飼料，常存在于各種霉變的堅果特別是花生和核桃及其制品中。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(world healthyorganizatiom，WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency for research on cancer，IARC)劃定為Ⅰ類致癌物。黃曲霉青毒素B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。黃曲霉毒素對人和動物健康的危害主要與其抑制蛋白質(zhì)的合成有關(guān)[3]，引起人的中毒表現(xiàn)主要是損害肝臟，發(fā)生肝炎、肝硬化、 肝壞死等。因此，世界各國對主要食品中黃曲霉毒素的總量，尤其是AFB1的含量規(guī)定了允許限量值。我國也明確規(guī)定了食品中真菌毒素的限量，其中規(guī)定玉米、花生及及其制品中AFB1的允許限量值為 20μg/kg[4]。

黃曲霉毒素在花生及糧食中廣泛而微量地存在，建立準(zhǔn)確靈敏、快速簡便的檢測方法是黃曲霉毒素研究的重要方面。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等快速篩選法[5-7]，薄層色譜掃描法(thin layer chromatography scan，TLCS)、高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS)等確證檢測法[8-13]，以及免疫傳感器陣列等其他新方法[14-18]。ELISA法適用于大批量樣品的快速篩選，具有檢測速度快、特異等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，且不能準(zhǔn)確定量；薄層色譜法(TLC)是測定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，屬于定性和半定量方法，為提高薄層色譜法的精度而建立的TLCS法在確證新發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素和檢測方法學(xué)研究等方面曾經(jīng)具有一定的優(yōu)越性，但是該法操作煩瑣、靈敏度低、定量不夠準(zhǔn)確，近年來應(yīng)用較少；HPLC結(jié)合紫外或熒光檢測器具有靈敏度高、檢測限低、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來在黃曲霉毒素檢測中得到了廣泛的應(yīng)用，但該法需進(jìn)行柱前或柱后衍生處理，操作繁雜，不適宜多種不同類霉菌毒素的同時檢測；LC-MS/MS法是近幾年興起的新技術(shù)，能夠提供結(jié)構(gòu)信息，且檢出限低、靈敏度高、線性范圍寬、簡便快捷，是多組分霉菌毒素檢測的理想方法。

本研究擬建立測定花生油中4種黃曲霉毒素(包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2)的LC-MS/MS法，并對方法的可靠性進(jìn)行評價。運(yùn)用所建立的方法對市售19種不同品牌和批次的花生油中的黃曲霉毒素進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品 美國 Alexis公司；甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純) 美國Fisher公司；三氯甲烷、正己烷等為國產(chǎn)分析純；花生油 市購。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；API 4000 Q-trap三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源(ESI) 美國ABI公司；MTN-2800W水浴氮吹儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；MS3 digital渦旋振蕩器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，梯度洗脫表見表1；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

表1 流動相梯度洗脫Table 1 Mobile phase gradients for HPLC analysis

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)正離子模式；電噴霧電壓5500V；離子源溫度500℃；多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitor，MRM)，4種待測物的定性離子對和定量離子對見表2；碰撞氣、霧化氣、氣簾氣、碰撞氣能量、聚焦電壓和碰撞室出口電壓均為最優(yōu)。

表2 4種待測物的定性離子對和定量離子對Table 2 Qualitative and quantitative ion pairs and quantitative ion pairs of four aflatoxins

1.3.3 樣品處理

稱取1.0g花生油樣品于離心管中，加入5mL正已烷溶解。再用5mL甲醇-水(55:45，V/V)萃取，4000r/min離心5min，吸取甲醇-水層至第二個離心管中，將原離心管中的樣品用甲醇-水再萃取一次，合并甲醇-水于第二個離心管中。用10mL三氯甲烷萃取兩次，合并三氯甲烷(20mL)，置于水浴氮吹濃縮至干。用乙腈-0.1%甲酸溶液(2:8，V/V)定容至1.0mL，經(jīng)0.22μm濾膜后，用于LC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

黃曲霉毒素難溶于水，不溶于石油醚、己烷和乙醚等非極性溶劑，但易溶于甲醇、丙酮和三氯甲烷等帶極性的有機(jī)溶劑。一般使用這幾種有機(jī)溶劑的水溶液作為提取劑[19-20]。提取劑中的水可以增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力，提高萃取效率。應(yīng)根據(jù)不同食品基質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的提取劑。大部分文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)均是使用甲醇-水或乙腈-水作為提取劑[2,11,21]，但考慮到乙腈比甲醇毒性大，而且價格昂貴，故本研究選擇甲醇-水作為花生油中黃曲霉毒素的提取劑。甲醇-水比例(55:45，V/V)的確定以及樣品的前處理過程以文獻(xiàn)[19]標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，并經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼{(diào)整與優(yōu)化(見1.3.3節(jié))。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取不同水平的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)建立的儀器條件進(jìn)行LC-MS/MS測定，20.0μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流色譜圖(extracted ion chromatography，XIC)如圖1所示。計算不同標(biāo)準(zhǔn)水平下的峰面積，以黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品水平/(μg/kg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。直線幾乎通過原點(diǎn)，故通過原點(diǎn)進(jìn)行線性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～20.0μg/kg的進(jìn)樣水平范圍內(nèi)線性良好。線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 黃曲霉毒素的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear regression equations and correlation coefficient of fours aflatoxins

圖1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of four aflatoxin standards in MRM mode

2.3 加標(biāo)回收率和方法精密度

取16號樣品(AFB1陽性)作為代表性樣品，添加低、中、高3個不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)建立的儀器條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗。每個加標(biāo)水平取6個平行樣，其回收率與精密度數(shù)據(jù)見表4。圖2為16號樣品的提取離子流色譜圖，圖3為16號加標(biāo)樣品的色譜圖。

圖2 16號樣品的提取離子流色譜圖Fig.2 Chromatograms of aflatoxins in blank sample No. 16

圖3 16號加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of aflatoxins in spiked

加標(biāo)水平20.0μg/kg。

表4 16號樣品中黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=6)Table 4 Average recovery rates and relative standard deviations for aflatoxins in sample No. 16 spiked at 3 levels (n = 6)

從表4可以看出，用本檢測方法進(jìn)行加標(biāo)回收實驗時，在低加標(biāo)水平條件下，4種黃曲霉毒素的平均回收率在70.8%～108.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在8.6%～9.7%之間；在中、高加標(biāo)水平下，平均回收率在82.4%～104.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.7%～7.9%之間，表明此方法的準(zhǔn)確度和精密度均較高。

2.4 樣品測定

運(yùn)用所建立的方法對市售19種不同品牌和批次的花生油中的黃曲霉毒素進(jìn)行分析，檢測結(jié)果見表5。

表5 花生油樣品黃曲霉毒素的檢測結(jié)果Table 5 Analytical results of aflatoxins in 16 commercial peanut iol sample

由表5可以看出，所有19種花生油樣品均受到不同程度的黃曲霉毒素的污染，尤其是黃曲霉毒素B1的污染最為廣泛，在所有樣品中均有檢出，其含量為0.4～18.5μg/kg。該含量值均在GB 2761—2005《食品中真菌毒素限量》規(guī)定的20μg/kg的允許限量值范圍內(nèi)，因此消費(fèi)者可以放心食用。該檢測結(jié)果表明，盡管樣品中幾種黃曲霉毒素的含量較低，通過本檢測方法可靈敏、準(zhǔn)確地對其含量進(jìn)行定量。

3 結(jié) 論

本研究建立了同時檢測花生油中4種黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并對不同品牌和批次的多種市售花生油樣品進(jìn)行了分析。實驗結(jié)果表明，本檢測方法可以實現(xiàn)黃曲霉毒素與樣品基質(zhì)的良好分離，檢測靈敏度高、選擇性好、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于花生油中4種黃曲霉毒素的定性、定量測定。

[1] 馬志科, 昝林森. 黃曲霉毒素危害、檢測方法及生物降解研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 30(9): 91-94.

[2] 王樹茂. 利用高效液相色譜檢測干(堅)果中的黃曲霉毒素[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(8): 112-115.

[3] 李書國, 陳輝, 李雪梅, 等. 糧油食品中黃曲霉毒素檢測方法綜述[J].糧油食品科技, 2009, 17(2): 62-65.

[4] GB 2761—2005 食品中真菌毒素限量[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

[5] GUAN Di, LI Peiwu, ZHANG Qi, et al. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based competitive enzyme immunoassay for aflatoxin M1in milk and infant milk products[J]. Food Chemistry, 2011, 125(4): 1359-1364.

[6] 齊惠萍, 呂建明, 李常青. ELISA 法檢測食醋中黃曲霉毒素B1方法的改進(jìn)[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2008, 20(4): 313-315.

[7] 江濤, 柳楨, 鄭佳, 等. 總黃曲霉毒素ELISA定量檢測方法的研制[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(4): 292-296.

[8] HAN Zheng, ZHENG Yunliang, LUAN Lianjun, et al. An ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2, M1and M2in traditional Chinese medicines[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 664(2): 165-171.

[9] NONAKA Y, SAITO K, HANIOKA N, et al. Determination of aflatoxins in food samples by automated on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(20): 4416-4422.

[10] TANAKA H, TAKINO M, SUGITA-KONISHI Y, et al. Development of a liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometric method for the simultaneous determination of trichothecenes, zearalenone and aflatoxins in foodstuffs[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry,2006, 20(9): 1422-1428.

[11] 朱聰英, 應(yīng)永飛, 韋敏玨, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中黃曲霉毒素的研究[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2010, 31(4): 240-246.

[12] 付朝暉, 黃雪祥, 閔順耕. 超高效液相色譜法快速測定發(fā)酵茶葉中的黃曲霉毒素[J]. 分析試驗室, 2009, 28(6): 112-115.

[13] MAHONEY N, MOLYNEUX R. Rapid analytical method for the determination of Aflatoxins in plant-derived dietary supplement and cosmetic oils[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(7): 4065-4070.

[14] ADAYI N, LEVKOVETS I, RODRIGUEZ-GIL S, et al. Development of immunosensor based on OWLS technique for determining Aflatoxin B1and Ochratoxin A[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22(6):797-802.

[15] ARDUINI F, ERRICO I, AMINE A, et al. Enzymatic spectrophotometric method for Aflatoxin b detection based on acetylcholinesterase inhibition[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(9): 3409-3415.

[16] PIERMARINI S, MICHELI L, AMMIDA N, et al. Electrochemical immunosensor array using a 96-well screen-printed microplate for Aflatoxin B1detection[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22(7):1434-1440.

[17] 湯俊琪, 龐廣昌. 免疫傳感器測定食品中黃曲霉毒素的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2009, 30(17): 326-329.

[18] 孫秀蘭, 汪忠云, 方銀軍, 等. 溶膠凝膠法固定抗體制備黃曲霉毒素免疫傳感器[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(2): 245-248.

[19] 王娜, 潘治利, 楊君麗, 等. 花生中黃曲霉毒素檢測方法的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(24): 10305-10306.

[20] 李軍, 田苗, 于一芒, 等. 免疫親和-光化學(xué)衍生高效液相色譜檢測花生及花生制品中黃曲霉毒素[J]. 分析測試學(xué)報, 2007, 26(1): 93-96.

[21] GB/T 5009.23—2006 食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

Simultaneous Determination of Four Aflatoxins in Peanut Oil by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Xiao-juan1，XIAN Yan-ping2，LUO Hai-ying2，QIAN Min1，BAI Wei-dong1,*
(1. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；2. Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou 510110, China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was established for simultaneous determination of 4 aflatoxins in peanut oil including aflatoxins B1, B2, G1 and G2. The sample preparation was achieved by sequential extraction with aqueous methanol solution and chloroform. The analytes were separated on a C18 column using a mobile phase composed of acetonitrile and 0.1% aqueous formic acid solution and detected using electrospray ionisation (ESI)-MS/MS in positive ion mode with multiple reaction monitoring (MRM). The linear range of aflatoxins determination was from 0.0 to 20.0μg/kg. The recovery rates for four aflatoxins were from 70.8% to 108.0% at 1.0μg/kg and from 82.4% to 104.5% at 10.0 and 20.0μg/kg, and the relative standard deviations from 5.7% to 9.7%. The developed method proved highly selective and sensitive in determining 19 commercial peanut oil samples, thus being suitable for qualitative and quantitative analysis of four aflatoxins in peanut oil.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)；aflatoxins；peanut oil；multi-reaction monitor (MRM)

TS207.3

A

1002-6630(2011)14-0194-04

2010-11-28

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(21005091)；粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項目(2009A020700005)

趙曉娟(1980—)，女，講師，博士，主要從事食品添加劑與食品分析研究。E-mail：xiao0692@163.com

*通信作者：白衛(wèi)東(1967—)，男，教授，碩士，主要從事食品化學(xué)與食品添加劑研究。E-mail：whitebai2001@yahoo.com.cn