劉 佳，焦士蓉*，唐遠(yuǎn)謀，唐鵬程，馮 慧

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性

劉 佳，焦士蓉*，唐遠(yuǎn)謀，唐鵬程，馮 慧

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

對(duì)苦丁茶中多酚的提取及抗氧化活性進(jìn)行研究。通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)52%、料液比1:24(g/mL)、提取時(shí)間62s、微波功率291W條件下可獲得最高的提取量115.40mg/g。苦丁茶多酚提取液對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的半清除質(zhì)量濃度以及對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制質(zhì)量濃度分別為29.24、34.14、872.3、11.48mg/L。表明苦丁茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

苦丁茶；多酚；提取；響應(yīng)面分析法；抗氧化

“苦丁茶”是我國(guó)一大類代茶植物或代茶產(chǎn)品的統(tǒng)稱。冬青屬苦丁茶主要產(chǎn)于我國(guó)南部及西南部地區(qū)，是民間傳統(tǒng)的藥用植物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦丁茶有防治心腦血管系統(tǒng)疾病、降低血壓、降脂、抗氧化等藥理保健作用[1]，其粗提物均有不同程度的抑菌作用[2]。由苦丁茶冬青葉片制成的苦丁茶是民間常用中草藥，是傳統(tǒng)中成藥“甘和茶”的主要原料之一[3]，含有豐富的黃酮、多酚、三萜類皂甙及金屬元素[4-5]，所含的各種成分的藥理作用及保健功能日益引起人們的關(guān)注[6]，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法，以苦丁茶冬青樹(shù)(I l e x KudinchaC.J.Tseng)葉片中的多酚含量作為響應(yīng)值，對(duì)苦丁茶多酚的提取工藝進(jìn)行探討，旨在得到最優(yōu)工藝條件，并通過(guò)幾個(gè)方面研究苦丁茶多酚的抗氧化性能，為苦丁茶保健成分的開(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦丁茶(市售)粉碎過(guò)80目篩；福林-酚試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DPPH自由基 美國(guó)Sigma公司；2-硫代巴比妥酸 上?？曝S化學(xué)試劑有限公司；其他常見(jiàn)試劑(分析純) 成都科龍化工試劑廠。

TB-214型電子天平 美國(guó)丹佛儀器設(shè)備廠；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(配有玻璃比色皿) 上海尤尼柯儀器有限公司；MP17C-KE家用微波爐 美的集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 多酚提取方法

稱取苦丁茶粉樣品2g，采用不同的提取溶劑，分別探究提取時(shí)間、料液比、微波功率因素對(duì)多酚得率的影響。

1.2.2 多酚提取量測(cè)定

采用福林-酚比色法[7-8]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0081x＋0.0286，R2=0.9999，計(jì)算公式為：

式中：p為總多酚類物質(zhì)提取量/(mg/g)；c為從回歸方程計(jì)算得到樣品中多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度/(μg/mL)；v為苦丁茶溶液的體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為茶粉質(zhì)量/g。

1.2.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除

按照文獻(xiàn)[9]的方法并做適當(dāng)修正：稱取2,2-二苯代苦味酰基(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品20mg，無(wú)水乙醇定容至500mL，得質(zhì)量濃度0.04mg/mL溶液。取此溶液3mL，加入不同質(zhì)量濃度樣品液1mL，室溫反應(yīng)30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，空白組以1mL無(wú)水乙醇代替樣品液，并按下式計(jì)算清除率：

1.2.3.2 對(duì)羥自由基的清除

按照金鳴等[10]的比色法，0.75mmoL/L的鄰二氮菲溶液1mL，加入pH7.4的磷酸緩沖溶液(PBS)2mL和蒸餾水1mL，充分混勻后，加入0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，然后再加入0.01%過(guò)氧化氫1mL，于37℃保持60min，在波長(zhǎng)536nm處測(cè)吸光度Ap；用1mL乙醇代替1mL過(guò)氧化氫，測(cè)得吸光度Ab，1mL不同質(zhì)量濃度的樣液代替蒸餾水，測(cè)得吸光度As。以下式計(jì)算苦丁茶多酚對(duì)OH自由基的清除率(H/%)：

1.2.3.4 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制

[12]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)，小鼠處死后取肝洗凈，剪碎，用生理鹽水制成3%的勻漿。取勻漿0.6mL，加入不同濃度樣液0.34mL，0.0024%過(guò)氧化氫0.2mL，0.03mmol/L硫酸亞鐵溶液0.2mL，于37℃水浴保溫60min后，加入2mL 20%三氯乙酸及2mL 0.67% TBA溶液，90℃保溫15min，用水冷卻至室溫，4000r/min離心20min，取上清液，在532nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，以水代替TBA的平行試驗(yàn)管調(diào)零，以蒸餾水代替料液的反應(yīng)管為空白管，抑制率(I/%)計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的篩選

圖1 溶劑對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.1 Effect of solvents on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

按照1.2.1節(jié)方法，在提取時(shí)間80s、料液比1:20、微波功率291W條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，提取溶劑為丙酮時(shí)，苦丁茶多酚提取量最高，乙醇次之；由于丙酮的毒性以及溶劑價(jià)格較高的因素，選取乙醇作為提取溶劑。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦丁茶多酚提取的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

按照2.1節(jié)方法，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，苦丁茶多酚的提取量最高，故乙醇體積分?jǐn)?shù)選取50%。

2.2.2 料液比對(duì)苦丁茶多酚提取的影響

圖3 料液比對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，其他條件同2.2.1節(jié)，改變料液比進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3。由圖3可知，當(dāng)料液比1:20 (g/mL)時(shí)苦丁茶多酚提取量最高，故選取料液比1:20(g/mL)。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)苦丁茶多酚提取的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

料液比1:20，其他條件同2.2.2節(jié)，改變提取時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為60s時(shí)，苦丁茶多酚提取量最大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)多酚提取量反而降低，可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致部分多酚類物質(zhì)被氧化或分解，故提取時(shí)間選取60s。

2.2.4 微波功率對(duì)苦丁茶多酚提取的影響

圖5 微波功率對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.5 Effect of microwave power on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

選取提取時(shí)間60s，其他條件同2.2.3節(jié)，改變微波功率，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，微波功率為291W時(shí)，苦丁茶多酚提取最高，但隨著微波功率的增大多酚提取量迅速降低，可能是因?yàn)楣β蔬^(guò)大加速了多酚類物質(zhì)的氧化分解或使溶劑大量揮發(fā)，故選取提取功率為291W。

2.3 響應(yīng)曲面法結(jié)果與分析

響應(yīng)曲面由法常用于優(yōu)化最佳測(cè)試條件[13-14]。由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)苦丁茶多酚提取率的影響較大，故選取這3個(gè)因素做Box-Behnken設(shè)計(jì)，并且以苦丁茶多酚提取量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken design tests

利用Design Expert軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析，得到多酚含量(Y)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=113.22＋2.50A＋3.92B－2.87C＋1.56AB＋1.02AC＋4.70BC－9.64A2－3.06B2－2.31C2

試驗(yàn)所選用模型P值為0.0019，極顯著(P＜0.05)，決定系數(shù)R2=0.9741，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有97.41%來(lái)源于所選變量，該方程的擬合情況好。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在；當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘曲面，有極大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無(wú)極值存在。

圖6 各兩因素交互作用對(duì)多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between ethanol conceration, material-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of polyphenols from Kuding tea

由圖6A可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦丁茶多酚提取量影響比較大，表現(xiàn)為曲線較陡，料液比對(duì)苦丁茶多酚提取量影響不是很大，表現(xiàn)為曲線較為平緩。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0水平，即50%時(shí)，多酚提取量最大，說(shuō)明過(guò)高過(guò)或過(guò)低的乙醇體積分?jǐn)?shù)均不適合苦丁茶多酚的提取。由圖6B可知，料液比對(duì)苦丁茶多酚提取量影響比較小，而提取時(shí)間對(duì)苦丁茶多酚提取影響較大，且較短的時(shí)間更有利于提取。圖6C進(jìn)一步說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦丁茶多酚提取量影響比較大，曲線較陡。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)輔助軟件Design Expert優(yōu)化提取條件得到多酚提取量最高的超過(guò)114.80mg/g的5組數(shù)據(jù)，分析這5組數(shù)據(jù)，得到苦丁茶多酚含量超過(guò)114.80mg/g的各參數(shù)的范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%～53%、料液比1:23～1:25(g/mL)、提取時(shí)間60～64s。經(jīng)以上分析，再綜合實(shí)驗(yàn)的好操作性，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)52%、料液比1:24、提取時(shí)間62s，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。根據(jù)回歸方程，計(jì)算其預(yù)測(cè)值為114.4832mg/g。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到平均結(jié)果為115.40mg/g，相對(duì)誤差為0.8%，證明響應(yīng)面優(yōu)化苦丁茶多酚的提取工藝可行。

2.5 抗氧化活性測(cè)定

2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除

圖7 苦丁茶多酚對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.7 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on DPPH free radicals

如圖7所示，由回歸方程得苦丁茶多酚對(duì)DPPH自由基的半清除質(zhì)量濃度EC50=29.24mg/L。

2.5.2 對(duì)羥自由基的清除

圖8 苦丁茶多酚對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on hydroxyl free radicals

由圖8回歸方程可得，苦丁茶多酚對(duì)OH自由基的半清除質(zhì)量濃度HC50=34.14mg/L。

圖9 苦丁茶多酚對(duì)O2·的清除作用Fig.9 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on superoxide anion ion free radicals

圖10 苦丁茶多酚對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.10 Inhibition rate of polyphenols from Kuming tea on lipid peroxidation

2.5.4 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制由圖10回歸方程計(jì)算可得，苦丁茶多酚對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制質(zhì)量濃度IC50=11.48mg/L。

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了苦丁茶多酚提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:20(g/mL)、提取時(shí)間60s、微波功率291W。

3.2 通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化，確定苦丁茶多酚提取的最佳試驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)52%、料液比

1:24(g/mL)、提取時(shí)間62s。以該優(yōu)化條件在微波功率291W時(shí)提取苦丁茶多酚含量達(dá)到115.40mg/g。

34.14、872.3mg/L，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制質(zhì)量濃度為11.48mg/L。

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Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Kuding Tea

LIU Jia，JIAO Shi-rong*，TANG Yuan-mou，TANG Peng-cheng，F(xiàn)ENG Hui
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

The optimal conditions for the extraction of Kuding tea polyphenols for achieving maximum extraction yield were determined by response surface methodology to be ethanol concentration of 52%, material/liquid ratio of 1:24 (g/mL), microwave power of 291 W, and microwave treatment time of 62 s. The extraction rate of polyphenols was 114.82 mg/g under the optimal extraction conditions. The IC50 values of the obtained extract against DPPH, hydroxyl, superoxide anion ion free radicals and lipid peroxidation were 29.24, 34.14, 872.3 mg/L and 11.48 mg/L, respectively, suggesting that Kuding tea polyphenols have a remarkable antioxidant effect.

Kuding tea；polyphenols；extraction；response surface analysis；antioxidant

TS272.2；TS272.5

A

1002-6630(2011)14-0134-05

2010-09-19

四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(09ZA158)；西華大學(xué)2008校人才培養(yǎng)與引進(jìn)科研項(xiàng)目(R0920501)

劉佳(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：liujia13568864205@163.com

*通信作者：焦士蓉(1968—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：jsrong2004@163.com