王玉明，任兵興，胡曉倩，張 蓓，杜 磊，王靜鳳，薛長湖

攝食魷魚對乳清酸誘導大鼠脂肪肝的影響

王玉明，任兵興，胡曉倩，張 蓓，杜 磊，王靜鳳，薛長湖*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

目的：研究攝食魷魚對脂肪肝大鼠脂肪代謝的影響。方法：24只大鼠分成3組，對照組喂食AIN76標準飼料，模型組飼料中添加1%乳清酸，魷魚組添加1%乳清酸和10%魷魚。飼喂10d后，分別測定大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，以及肝臟TC、TG、磷脂含量。同時測定肝臟中脂肪酸合成酶(FAS)、蘋果酸酶(ME)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)、肉堿棕櫚酰轉移酶(CPT-1)和過氧化物酶體β-氧化酶系活性。結果：乳清酸可顯著升高大鼠肝臟以及血清TC、TG含量，升高FAS、ME和G6PDH活性，并降低CPT-1的活性。添加魷魚后，顯著降低了乳清酸誘導的脂肪肝模型大鼠的肝臟以及血清TC、TG水平，降低了FAS、ME、G6PDH活性并升高了過氧化物酶體β-氧化酶系活性。攝食乳清酸降低了大鼠總脂和中性固醇的排泄，攝食魷魚后對大鼠總脂排泄無顯著影響，但降低了中性固醇的排泄。結論：攝食魷魚可以通過降低乳清酸誘導的脂肪肝模型大鼠的脂肪酸合成酶活性和升高過氧化物酶體β-氧化酶系活性來抑制脂肪肝大鼠肝臟脂質蓄積。

魷魚；脂肪肝；乳清酸；脂質代謝；酶活

魷魚屬無脊椎海洋動物，頭足綱中的槍烏賊科和魷魚科的統(tǒng)稱，是海洋肉食性動物。我國傳統(tǒng)醫(yī)學認為，魷魚有滋陰養(yǎng)胃、補虛潤膚的功能。魷魚因其風味可口、營養(yǎng)價值高等原因成為人們較為喜好的海產品。魷魚雖然膽固醇含量較高，可食部的體壁和頭足中膽固醇含量可達181mg/100g，但是，已有的研究表明，攝食魷魚并不升高大鼠和小鼠的血脂水平[1-4]。然而前期的實驗結果表明，攝食魷魚在降低小鼠血清脂肪濃度的同時，卻使得肝臟脂肪濃度顯著上升[3-4]，因此攝食魷魚對脂肪肝的影響亟待明確。

脂肪肝可分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，通過乳清酸誘導的脂肪肝模型屬于非酒精性脂肪肝，該模型穩(wěn)定可靠，適用于各種病理性脂肪肝的形成防治研究[5]。通過在大鼠飲食中添加1%乳清酸，可在3～10d誘導產生脂肪肝模型[6-8]，這一現象于1955年由Standerfer等[9]報道，并在眾多研究中得到應用證實。本實驗研究魷魚攝食對脂肪肝大鼠脂肪肝的影響，為其合理食用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿根廷魷魚胴體由青島海通集團貿易有限公司提供，魷魚勻漿凍干后，測得魷魚蛋白質含量為87.0%、脂肪含量為8.51%、膽固醇含量為0.96%。

健康SD大鼠，SPF級，雄性，5周齡，體質量120～140g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2007-0001。

維生素和礦物質混合物(AIN76) 日本農工株式會社；乳清酸 日本和光純藥株式會社；丙二酰-CoA、乙酰-CoA、還原型輔酶Ⅱ、棕櫚酰-CoA、L-肉堿 美國Sigma公司；膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司，其他試劑為國產生化純。

1.2 儀器與設備

Model680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；UV-2550分光光度計 日本島津公司；CP100MX離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 飼料配制

24只大鼠按體質量隨機分為正常對照組、乳清酸模型組和魷魚組，每組8只。

表1 動物飼料配比Table 1 Composition of feed for experimental rats %

飼料以AIN76[10]標準配方為基礎配制。正常對照組和乳清酸模型組中蛋白源為20%酪蛋白，魷魚組添加10%蛋白含量的魷魚凍干粉和10%的酪蛋白，使飼料蛋白含量達20%。用玉米油將各組脂肪含量調整至10%。對照組不添加乳清酸，模型組和魷魚組分別添加1.0%乳清酸。飼料中除乳清酸和蔗糖外的其他成分按AIN76標準配方配制，并用蔗糖調整至100%。具體組成如表1所示。

1.3.2 動物喂養(yǎng)與取材

室溫(22±2)℃，12h:12h明暗交替，飼料和水自由攝食，飼料每日更新并測定攝食量，體質量隔日測定，連續(xù)喂食10d。實驗結束前連續(xù)3d收集糞便，凍干備用。末次喂食后，禁食不禁水12h，乙醚麻醉后，腹主動脈取全血處死；血液室溫靜置30min，8000r/min離心獲得血清；取肝臟于-80℃保存，備用。

1.3.3 血清、肝臟、排泄物脂質濃度測定

血液室溫靜置30min后，7000r/min離心獲得血清，按試劑盒說明書測定TC、TG、HDL-C濃度。肝臟脂質按Folch方法提取[11]，肝臟TC、TG含量由試劑盒測定，磷脂(phospholipid，PL)含量參照Bartlett等[12]方法測定。排泄物凍干后，用混合液(石油醚、乙醚、乙醇體積比1:1:1)抽提總脂并稱質量，中性固醇用Folch法抽提并用試劑盒測定。

動脈粥樣硬化指數(AI)按下式計算。

式中：cTC為TC含量/(mmol/L)；cHDL-C為HDL-C含量/(mmol/L)。

1.3.4 肝臟脂肪代謝相關酶活性測定

用含有0.25mol/L蔗糖和1mmol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)于4℃制備肝勻漿，以700×g離心10min，去除沉淀。上清液先以10000×g離心10min，收集沉淀(此為線粒體)，按文獻[13-14]方法用于肉堿棕櫚酰轉移酶(carnitin palmitoyl transferase，CPT)、過氧化物酶體β-氧化酶系(β過氧化物酶系)活性測定。二次離心所得上清液再以125000×g離心60min，收集上清液用于測定脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、蘋果酸酶(ME)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)活性，方法參照文獻[15]，各酶活力以單位質量蛋白計。

1.3.5 數據處理方法

2 結果與分析

2.1 攝食魷魚對脂肪肝大鼠血清脂質濃度的影響

表2 進食魷魚對大鼠血清脂質濃度的影響(n=8)Table 2 Effects of dietary squid on serum lipid concentrations in rats (n=8)

圖1 攝食魷魚對大鼠肝臟脂質代謝相關酶活性的影響(n=8)Fig.1 Effects of dietary squid on enzymes involved in hepatic lipid metabolism (n=8)

由表2可見，大鼠攝食添加乳清酸的飼料后，血清TC水平未見顯著變化，但血清TG、HDL-C濃度顯著升高，同時模型組動脈粥樣硬化指數有下降趨勢。攝食魷魚后，脂肪肝大鼠的血清TC、TG和HDL-C顯著下降，與以往實驗中[3-4]喂食小鼠后血脂代謝情況一致。模型組AI顯著降低，食用魷魚后AI與正常對照組和模型組相比均無顯著性差異。

2.2 攝食魷魚對脂肪肝大鼠肝臟脂質濃度的影響

表3 進食魷魚對大鼠肝臟脂肪代謝的影響(n=8)Table 3 Effects of dietary squid on hepatic lipid concentrations in rats (n=8)

由表3可見，模型組大鼠肝臟的TC、TG濃度相比于正常對照組升高了102%、481%(P＜0.01，P＜0.01)，顯示乳清酸大鼠脂肪肝模型造模成功。攝食魷魚的大鼠肝臟TC、TG濃度分別較模型組降低了87.4%和46%(P＜0.05，P＜0.05)，表明攝食魷魚可以顯著抑制脂肪肝大鼠肝臟中性脂質的蓄積。攝食魷魚對大鼠肝臟磷脂水平無顯著性影響。

2.3 攝食魷魚對脂肪肝大鼠肝臟脂質代謝相關酶活性的影響

由圖1可見，添加乳清酸顯著升高了脂肪酸合成相關酶FAS、ME和G6PDH 的活性，與正常對照組相比，分別升高了38.5%、50.2%和43.6%。另外，攝食乳清酸后，大鼠肝臟脂肪酸β氧化關鍵酶CPT-1的活性降低了61.6%，但過氧化物酶體β氧化酶系無顯著變化。由此可知，攝食乳清酸顯著促進了脂肪酸的合成并降低了脂肪酸的分解。攝食魷魚后，與乳清酸模型組相比，大鼠肝臟脂肪酸合成相關酶FAS、ME和G6PDH 的活性，分別降低了65.2%、77.9%和53.8%，并且相對于正常對照組也下降顯著。攝食魷魚對乳清酸模型組的CPT-1活性無顯著影響，但顯著升高了過氧化物酶體β氧化酶系的活性。

2.4 攝食魷魚對脂肪肝大鼠糞便中總脂肪和中性固醇的影響

由表4可見，攝食乳清酸降低了大鼠總脂和中性固醇的排泄，而相對于模型組攝食魷魚后大鼠總脂排泄雖無顯著變化，但是中性固醇的排泄卻顯著降低。

表4 進食魷魚對大鼠糞便中總脂和中性固醇的影響(n=8)Table 4 Effects of dietary squid on fecal lipid and neutral steroid excretion in rats (n=8)

3 討 論

非酒精性脂肪肝是肝臟脂肪代謝異常引起肝臟內甘油三酯蓄積過多的病理狀態(tài)。非酒精性脂肪肝如果不能得到有效的控制將演變?yōu)橹拘愿窝住⒏卫w維化甚至是肝癌?，F階段，非酒精性脂肪肝動物模型一般有兩種：一種是特殊種系動物的先天遺傳性脂肪肝模型，這類造模方法由于涉及基因敲除等技術，成本較高；另一類是利用飲食或者藥物誘發(fā)形成的模型，該方法操作相對簡便，重復性較好，故得以廣泛推廣。大鼠食用添加1%乳清酸的飼料10d后，大鼠肝臟TC和TG水平顯著升高，形成脂肪肝。攝食魷魚后，脂肪肝大鼠的肝臟脂質濃度顯著下降，肝臟TC和TG濃度均顯著低于模型組，表明魷魚的攝食可顯著改善乳清酸誘導的大鼠脂肪肝。

研究表明，攝食乳清酸引起的大鼠脂肪肝與肝臟TG積累和肝臟脂肪合成增加有關[7,16]。肝臟脂質代謝過程中，多種酶參與了脂肪酸的合成代謝，ME和G6PDH為脂肪酸合成提供NADPH，FAS可催化乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成脂肪酸，是肝臟脂肪酸合成的關鍵限速酶。酶活性測定結果顯示，攝食乳清酸后，大鼠肝臟ME、G6PDH以及FAS活性均顯著高于正常對照組，與文獻報道一致[17]。攝食魷魚后，ME、G6PDH和FAS的活性不僅顯著低于模型組，甚至低于正常對照組，而Tanaka 等[1]對魷魚的研究同樣證明攝食魷魚可以抑制大鼠肝臟內甘油三酯的合成。另外，CPT-1和過氧化物酶體β-氧化酶系是脂肪酸分解的重要酶系，CPT-1位于線粒體外膜，可以催化脂酰-CoA轉化為脂酰-肉堿，進一步向線粒體內部運輸，是線粒體脂肪酸β-氧化過程的限速酶。而在長鏈脂肪酸β-氧化反應中，過氧化物酶體β-氧化酶系的氧化能力占脂肪酸β-氧化總量的5%～30%，是影響脂肪酸β-氧化反應的重要因素。脂肪酸分解酶活性測定結果顯示，模型組大鼠肝臟CPT-1活性顯著降低，過氧化物酶體β-氧化酶系無顯著變化，而攝食魷魚后，CPT-1活性雖然和模型組相差不大，但是過氧化物酶體β-氧化酶系活性顯著升高。上述結果表明，攝食魷魚可以降低肝臟脂肪酸合成相關酶活性并升高脂肪酸分解酶的活性，進而抑制脂肪肝大鼠肝臟內脂質的蓄積。

魷魚中富含n-3多不飽和脂肪酸和牛磺酸。流行病學調查表明，日常攝入較多的富含多不飽和脂肪酸的海產品可以顯著降低脂肪肝發(fā)病率[18]。動物實驗結果顯示，攝食魚油可以降低Fischer344(F344)大鼠的體質量、體脂肪和肝臟脂肪，同時可以升高禁食后F334大鼠過氧化物酶增殖體激活受體a(PPARa)、CPT-1和?；o酶A (ACO)活性，降低FAS、肝組織固醇調節(jié)元件結合蛋白-1C(SREBP-1C)和硬脂酰CoA去飽和酶-1 (SCD-1)的活性[19]。而對于?；撬岬难芯客瑯幼C明，?；撬峥梢杂行е委煼蔷凭灾靖蝃20]。因此，攝食魷魚降低脂肪肝大鼠肝臟內的脂肪蓄積可能與魷魚中含有豐富的魚油和牛磺酸有關。

體內脂肪的蓄積與食物中脂肪的消化吸收率密切相關，本研究進一步考察攝食魷魚對乳清酸誘導的脂肪肝大鼠脂質的消化和吸收的影響，結果顯示，攝食魷魚后，大鼠總脂質和中性固醇的排泄未見升高，表明攝食魷魚對乳清酸誘導的大鼠脂肪肝的改善作用與脂質的消化和吸收無關。

綜上所述，攝食魷魚可以有效抑制乳清酸誘導的脂肪肝肝臟脂肪蓄積?？赡軐Ψ蔷凭灾靖斡幸欢ǖ念A防作用。

[1]TANAKA K, IKUO I, HIROKO Y, et al. Effect of dietary defatted squid on cholesterol metabolism and hepatic lipogenesis in rats[J]. Lipids, 2001, 36(5): 461-466.

[2]TANAKA K, SAKAI T, IKEDA I, et al. Effects of dietary shrimp, squid and octopus on serum and liver lipid levels in mice[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(7): 1369-1375.

[3]王玉明, 任兵興, 馬琴, 等. 攝食魷魚對小鼠脂質代謝的影響[J]. 中國海洋大學學報, 2009, 39(3): 409-412.

[4]任兵興, 王玉明, 胡曉倩, 等. 攝食魷魚對小鼠脂質代謝的影響研究[J]. 南方水產, 2009, 5(3): 41- 45.

[5]張玉峰, 陳文慧. 非酒精性脂肪肝動物模型造模方法的研究[J]. 中西醫(yī)結合肝病, 2002, 12(2): 123-125.

[6]HARDEN K K, ROBINSON J L. Hypocholesteremia induced by orotic acid: dietary effects and species specificity[J]. J Nutr, 1984, 114: 411-421.

[7]FUKUWATARTI T, MORIKAWA Y, SUGIMOTO E, et al. Effects of fatty liver induced by Niacin-free diet with orotic acid on the metabolism of tryptophan to niacin in rats[J]. Biosc Biotechnol Biochem, 2002, 66 (6): 1196-1204.

[8]GRIFFIN J L, BONNEY S A, MANN C, et al. An integrated reverse functional genomic and metabolic approach to understanding orotic acidinduced fatty liver[J]. Physiol Genomics, 2004, 17(2): 140-149.

[9]STANDERFER S B, HANDLER P. Fatty liver induced by orotic acid feeding[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1955, 90(1): 270-271.

[10]Report of the American institute of nutrition ad hoc committee on standards for nutritional studies[J]. J Nutr, 1977, 107(11): 1340-1348.

[11]FOLCH J M L, SLANE-STANLEY G H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J]. J Biol Chem, 1957, 226(1): 497-506.

[12]BARTLETT G R. Colorimetric assay methods for free and phosphorylated glyceric acids[J]. J Biol Chem, 1958, 234(3): 466-469.

[13]MARKWELL A K, MCGROARTY E J, BIEBER L L, et al. The sub cellular distribution of carnitine acyltransferases in mammalian liver and kidney[J]. J Biol Chem, 1973, 248(10): 3433-3440.

[14]LAZAROW P B. Assay of peroxisomalβ-peroxisomal of fatty acids [M]. New York: Academic Press, 1981: 315-319.

[15]KELLEY D S, KLETZIEN R F. Ethanol modulation of the hormonal and nutritional regulation of glucose 6-phosphate dehydrogenase activity in primary cultures of rat hepatocytes[J]. Biochem J, 1984, 217(5): 543-549.

[16]CHA J Y, MAMEDA Y, YAMAMOTO K, et al. Association between hepatic triacylglycerol accumulation induced by administering orotic aid and enhanced phosphatidate phosphohydrolase activity in rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(3): 508-513.

[17]BUANG Y, WANG Y M, CHA J Y, et al. Dietary phosphatidylcholine alleviates fatty liver induced by orotic acid[J]. Nutrition, 2005, 21(7/8): 867-873.

[18]王碧芬, 江瑞華. 脂肪肝患者與海鮮飲食的相關性調查[J]. 海峽科學, 2009, 35(11): 36-37.

[19]LEVY J, CLARE J N, STEVENS W. Dietary n-3 polyunsaturatde fattyacids decrease hepatic triglycefides in Fischer 344 rates[J]. Hepatology, 2004, 39(3): 608-616.

[20]楊建新, 鄒劍銘, 白錄軍. ?；撬嶂委煼蔷凭灾靖闻R床觀察[J].陜西醫(yī)學雜志, 2007, 36(3): 354-355.

Effects of Dietary Squid on Lipid Metabolism in Rats with Orotic Acid-induced Fatty Liver

WANG Yu-ming，REN Bing-xing，HU Xiao-qian，ZHANG Bei，DU Lei，WANG Jing-feng，XUE Chang-hu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To investigate the effect of dietary squid on lipids metabolism in fatty liver in rats. Methods: Twenty four male SD rats were randomly divided into 3 groups and control group. The control was fed AIN76 diet and model group AIN76 diet plus 1% orotic acid, while squid group AIN76 diet plus 1% orotic acid and 10% squid. After 10 days, serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC)，and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels were determined. Hepatic lipid concentrations (TG, TC, PL) and the activities of malic enzyme (ME), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), fatty acid synthase (FAS), carnitin palmitoyl transferase (CPT), peroxisomal β-oxidation enzymes were also examined. Results: After fed orotic acid, liver TC and TG levels were significantly increased, so did the activity of FAS, ME and G6PDH, but the activity of CPT drop. Taking squid could reduce the liver TC and TG and the activity of FAS, ME, G6PDH but increased the activity of peroxisomal β-oxidation enzymes in orotic acid-induced fatty liver in rats. Conclusion: This study indicated that the dietary squid could inhibit liver lipids cumulating in orotic acid-induced fatty liver in rats by reducing the activity of FAS, ME and G6PDH and increasing the activity of peroxisomal β-oxidation enzymes.

squid；fatty liver；orotic acid；lipids metabolism；enzyme activity

R151.2

A

1002-6630(2011)03-0212-04

2010-05-10

國際科技合作項目(2010DFA31330)

王玉明(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)。E-mail：wangyuming@ouc.edu.cn

*通信作者：薛長湖(1964—)，男，教授，博士，研究方向為水產品加工。E-mail：chxue@ouc.edu.cn