陳芳溶，徐曉云，張 敏，潘思軼，李秀娟

米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物分析

陳芳溶，徐曉云，張 敏，潘思軼，李秀娟*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

米發(fā)糕是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在我國(guó)尤其是南方地區(qū)頗受消費(fèi)者歡迎。本實(shí)驗(yàn)利用16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)米發(fā)糕在室溫儲(chǔ)藏過(guò)程分離出的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：細(xì)菌是致使米發(fā)糕迅速腐敗的主要因素，分離出的3株菌經(jīng)鑒定分別為發(fā)酵乳桿菌、巴氏葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。對(duì)米發(fā)糕腐敗菌的菌相變化進(jìn)行分析，確定乳桿菌和芽孢桿菌是米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，且都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)。

米發(fā)糕；微生物；分離；鑒定；優(yōu)勢(shì)腐敗菌

米發(fā)糕是中國(guó)的傳統(tǒng)大米發(fā)酵食品，主要以秈米為原料，經(jīng)浸泡、磨漿、發(fā)酵并汽蒸而成[1]。由于其特殊的風(fēng)味及松軟的口感，在中國(guó)尤其是南方地區(qū)頗受消費(fèi)者喜愛(ài)。但由于微生物引起的腐敗變質(zhì)和淀粉的回生，使其貨架期短，長(zhǎng)期以來(lái)都只能現(xiàn)做現(xiàn)賣(mài)。其中影響米發(fā)糕貨架期的主要因素是微生物引起的腐敗變質(zhì)[2]，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，故研究?jī)?chǔ)藏中的微生物變化對(duì)其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。本研究對(duì)影響米發(fā)糕腐敗變質(zhì)的主要微生物進(jìn)行了分析，并對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定以確定其優(yōu)勢(shì)腐敗菌，為建立有效的防腐措施和延長(zhǎng)貨架期提供參考。目前菌種分類(lèi)鑒別通常采用形態(tài)特征、培養(yǎng)特征觀察與核酸序列測(cè)定相結(jié)合的方法。其中相當(dāng)有效的是采用PCR擴(kuò)增16S rDNA進(jìn)行序列分析[3]，并與16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列數(shù)據(jù)比較，以鑒定樣本中存在的微生物種類(lèi)[4]。這為未知菌的鑒定及微生物的系統(tǒng)發(fā)育提供了一種較好的方法[5]，目前在細(xì)菌遺傳多樣性及菌種鑒別的研究中已得到廣泛的應(yīng)用[6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早秈米 市售。

dNTPs、10×Buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶生工生物工程(上海)有限公司；DNA Marker TaKaRa生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JL-100型電動(dòng)多用磨漿機(jī) 重慶市友昌機(jī)械制造有限責(zé)任公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；PE9600型PCR儀 美國(guó)PE公司；Gel-Logic200凝膠掃描成像系統(tǒng) 美國(guó)柯達(dá)公司；B203型生物顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基[9-10]

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯 青島海博生物技術(shù)有限公司。

PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g、酵母浸出物2.5g、葡萄糖1g、瓊脂15g，蒸餾水l000mL，調(diào)pH7.0，121℃滅菌15min。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g、瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液100mL、蒸餾水1000mL、氯霉素0.1g。121℃滅菌20min。

MRS瓊脂：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提出物5g、磷酸氫二鉀2g、檸檬酸按2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫-80 lmL、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂15g，蒸餾水l000mL，調(diào) pH6.2～6.4，121℃滅菌15min。

錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂：胰蛋白胨10g、硫酸錳0.0308g、瓊脂20g、牛肉膏3g、氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，調(diào)pH7.2～7.4，12l℃滅菌15min。

MSA-甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏1g、蛋白胨 10g、D-甘露醇10g、氯化鈉75g、酚紅0.025g，蒸餾水1000mL。調(diào)pH7.4，121℃滅菌15min。

1.4 米發(fā)糕制作工藝

其中：磨漿(米-水質(zhì)量比1:0.8)；米漿-發(fā)酵菌種質(zhì)量比1:0.05，菌種從米發(fā)糕老漿中分離培養(yǎng)、優(yōu)化得到；發(fā)酵溫度34℃發(fā)酵4h，汽蒸時(shí)間15min。

1.5 米發(fā)糕貯藏中微生物分析

1.5.1 樣品

米發(fā)糕蒸制成熟后，用保鮮膜包好，25℃恒溫儲(chǔ)存，于0、2、4、6、8、1 0、1 2 d分別取樣，進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群和霉菌總數(shù)的測(cè)定。

1.5.2 細(xì)菌、大腸菌群及霉菌總數(shù)測(cè)定

無(wú)菌條件下準(zhǔn)確稱(chēng)取25g樣品，加入225mL、0.85%滅菌生理鹽水中，振蕩均勻后，即成10-1的稀釋液，然后依次10倍遞增稀釋成所需的濃度梯度。每個(gè)平皿接入lmL菌懸液，然后分別倒入細(xì)菌和霉菌的培養(yǎng)基，混勻、凝固后置恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。細(xì)菌于36℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)；霉菌于30℃培養(yǎng)5d后計(jì)數(shù)。同時(shí)，接種1mL菌懸液于LST肉湯管中，36℃培養(yǎng)24h后觀察管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生。其中，菌落總數(shù)測(cè)定參照GB/T 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，大腸菌群測(cè)定參照 GB/T 4789.3—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》，霉菌計(jì)數(shù)按 GB/T 4789.15—1994《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》規(guī)定執(zhí)行。

1.6 細(xì)菌的分離、純化和鑒定

1.6.1 分離與純化

從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑出典型生長(zhǎng)的單一菌落，平板劃線法反復(fù)分離純化，得到純化的單個(gè)菌落，然后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)胞形態(tài)，對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行初步分析[12]。

1.6.2 培養(yǎng)特征觀察

觀察并記錄已分離純化的單個(gè)菌落的菌落形態(tài)，包括大小、形狀、隆起程度、表面形態(tài)、邊緣結(jié)構(gòu)、黏度、透明度、質(zhì)地及顏色等。

1.6.3 形態(tài)特征觀察

挑取分離純化得到的單一菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌株革蘭氏染色結(jié)果及個(gè)體形態(tài)，包括細(xì)胞的形狀、細(xì)胞間的排列方式、有無(wú)芽孢等。

1.6.4 菌株的16S rDNA 基因同源性分析

使用滅菌牙簽挑取分離純化的單菌落，置于裝有38 μL ddH2O的Microtube中95℃熱變性5min，然后迅速加入PCR反應(yīng)體系[13]：1)反應(yīng)引物：采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物[14-15]；引物1(1 4 9 2 R)：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，引物2(27F)：5＇-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3＇。2)反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL， Mg2+(25mmol/L)3 μL，d NTPs (each 25mmol/L) 1μL，引物1(27F) 1μL，引物2(1492R) 1μL，Taq酶(5U/μL)1μL。3)反應(yīng)條件：94℃，預(yù)變性5min；94℃，變性1min；50℃退火1min；72℃延伸2min；30次循環(huán)；72℃，延伸10min。

1.6.5 瓊脂糖凝膠電泳

取1μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6.616 S rDNA序列的測(cè)序

PCR 產(chǎn)物由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6.716 S rDNA序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站，使用Blast軟件[16]，將測(cè)定得到的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，進(jìn)行同源性比較。 采用Dnaman軟件包進(jìn)行多重序列比較，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

1.7 細(xì)菌菌相變化

按1.5.2節(jié)的方法在每個(gè)平皿中接入l mL菌懸液，然后分別倒入不同菌相的選擇性培養(yǎng)基，混勻。凝固后置恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

表1 不同細(xì)菌菌相的培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of different bacteria

2 結(jié)果與分析

2.1 米發(fā)糕儲(chǔ)存中微生物分析

米發(fā)糕是一種高水分易腐敗食品，圖1是25℃條件下米發(fā)糕細(xì)菌總數(shù)變化曲線。新鮮米發(fā)糕的細(xì)菌總數(shù)＜10(lg(CFU/g))，儲(chǔ)藏第7天，細(xì)菌總數(shù)顯著升高, 遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家規(guī)定的糕點(diǎn)銷(xiāo)售標(biāo)準(zhǔn)[17]。在這個(gè)期間內(nèi)，細(xì)菌總數(shù)一直呈上升趨勢(shì)。霉菌生長(zhǎng)情況如圖2所示，可以觀察到，霉菌生長(zhǎng)較緩慢，從第7天開(kāi)始生長(zhǎng)，到第12天顯著增加，之后米發(fā)糕表面有霉斑出現(xiàn)。另外，在米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中，一直未有大腸菌群檢出。因此，細(xì)菌是導(dǎo)致米發(fā)糕迅速腐敗變質(zhì)的主要因素。故本研究將繼續(xù)對(duì)細(xì)菌菌種作進(jìn)一步的分析。的主要腐敗細(xì)菌是芽抱桿菌和葡萄球菌。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的菌株進(jìn)行分離純化，運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行鑒別，確定米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中存在3種細(xì)菌，再結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育數(shù)分析，確定這3株菌分別為：發(fā)酵乳桿菌、巴氏葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。

圖1 米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)變化Fig.1 Change of total bacteria in fermented rice cake during storage

2.2.1 菌株菌落培養(yǎng)特征觀察

在米發(fā)糕貯藏過(guò)程中，共分離到3株具有典型菌落形態(tài)的細(xì)菌，其中，有兩株菌都是比較小的圓形菌落，另一株是較大的有凸起、褶皺和邊緣不整齊的圓形菌落。其菌落形態(tài)特征如表2所示。

表2 典型菌株菌落形態(tài)Table 2 Colonial morphology of typical strains

2.2.2 菌株形態(tài)特征觀察

圖3 菌株革蘭氏染色圖片F(xiàn)ig.3 Pictures of Gram strains

圖2 米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中霉菌總數(shù)變化Fig.2 Change of total mold in fermented rice cake during storage

對(duì)分離到的3株菌分別進(jìn)行革蘭氏染色，由圖3可知，3株菌都是革蘭氏陽(yáng)性菌，其中圖3a是具圓端的短桿菌，并形成鏈狀(菌株1)，圖3b菌體呈球形，排列成葡萄串狀(菌株2)，圖3c有明顯的芽孢存在(菌株3)。

2.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢驗(yàn)

2.2 細(xì)菌的分離、純化和鑒定

鑒定細(xì)菌的傳統(tǒng)方法主要是依據(jù)形態(tài)特征和生理生化特性，該法往往不能反映被鑒定物種與其他物種之間的親緣關(guān)系，一般只能鑒定到屬水平；而采用生物技術(shù)通過(guò)對(duì)大分子的分析從而對(duì)微生物進(jìn)行分類(lèi)鑒定，則能準(zhǔn)確反映物種之間的親緣關(guān)系，能鑒定到種水平。te Giffel等[18]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽抱桿菌和短小芽抱桿菌是烘焙制品中的主要腐敗菌。而Ji等[19]發(fā)現(xiàn)松糕中

圖4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products

挑取分離純化的單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并取擴(kuò)增產(chǎn)物1μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，3個(gè)樣品都在1000～2000bp 處出現(xiàn)清晰明亮的條帶，見(jiàn)圖4，表明所測(cè)菌株的16S rDNA基因擴(kuò)增成功。

2.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序與細(xì)菌16S rDNA基因序列分析

將PCR產(chǎn)物送于上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)得3株菌的16S rDNA序列片段長(zhǎng)度分別為：974、1089bp和1132bp，序列見(jiàn)圖5。

圖5 菌株的16S rDNA序列片段Fig.5 16S rDNA sequence fragments of bacterial strains

將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI進(jìn)行序列同源性比對(duì)，并把GenBank上與細(xì)菌16S rDNA相似度較大的序列載入DNAMAN軟件包中，進(jìn)行多重序列比較，再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如表3所示。菌株1與Lactobacillus fermentum最為接近，16S rDNA基因相似性達(dá)到100%。菌株2與Staphylococcus pasteuri同源性達(dá)到99%。菌株3與Bacillus cereus同源性為98%。而且菌株1(C12481)與HM035543(Lactobacillus fermentum strain 338-1-1)構(gòu)成一個(gè)分支；菌株2(12482)與EU379258(Staphylococcus pasteuri strain 1RN-4A)在一個(gè)分支；菌株3(C12484)與HM015630(Bacillus cereus strain DZ103)在同一個(gè)分支，見(jiàn)圖6。2.3米發(fā)糕儲(chǔ)藏中細(xì)菌菌相變化及優(yōu)勢(shì)腐敗菌分析

表3 分離菌株16S rDNA序列同源性比對(duì)Table 3 16S rDNA sequence identity of bacterial strains

圖6 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of bacterial strains

在米發(fā)糕儲(chǔ)藏過(guò)程中，共分離并鑒別出3種細(xì)菌，表4反映了室溫儲(chǔ)藏條件下米發(fā)糕細(xì)菌總數(shù)、乳桿菌、葡萄球菌和芽孢桿菌的生長(zhǎng)變化規(guī)律。在實(shí)驗(yàn)條件下，3種菌都不同程度影響了產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。其中，優(yōu)勢(shì)腐敗菌是乳桿菌和芽孢桿菌，且都呈持續(xù)上升趨勢(shì)。葡萄球菌呈先上升后下降趨勢(shì)，但在整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中其相對(duì)量較小?？偟膩?lái)說(shuō)，米發(fā)糕中所含腐敗菌種類(lèi)較少，一方面是由于經(jīng)過(guò)高溫蒸煮后，大部分細(xì)菌被殺滅。另一方面，乳酸菌是大米原料中含量最多的一種微生物，在發(fā)酵過(guò)程中，由于其繁殖產(chǎn)生大量乳酸或其他有機(jī)酸，使微環(huán)境pH值顯著下降[20]，從而在儲(chǔ)藏中很好地抑制了其他微生物生長(zhǎng)。另外芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成環(huán)境低氧，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類(lèi)，進(jìn)一步降低了環(huán)境pH值，間接抑制其他腐敗菌的生長(zhǎng)。

表4 米發(fā)糕室溫(25℃)儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌的菌相變化Table 4 Microbial change of fermented rice cake during the storage at 25 ℃

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響米發(fā)糕貨架期的主要微生物進(jìn)行研究，應(yīng)用PCR技術(shù)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)儲(chǔ)藏中分離出的細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)行了鑒定和分析。結(jié)果表明，在室溫條件下，細(xì)菌是導(dǎo)致米發(fā)糕迅速腐敗的最主要因素，隨著米發(fā)糕儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌總數(shù)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，并在第7天急劇上升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中，未檢測(cè)出大腸桿菌，而霉菌生長(zhǎng)較為緩慢。綜合細(xì)菌菌落形態(tài)、PCR鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，確定分離得到的細(xì)菌分別是：Lactobacillus fermentum (發(fā)酵乳桿菌)，Staphylococcus pasteuri (巴氏葡萄球菌)，和Bacillus cereus(蠟樣芽胞桿菌)。通過(guò)對(duì)腐敗菌菌相分析，表明3種菌都不同程度影響了米發(fā)糕的腐敗變質(zhì)，其中乳桿菌和芽孢桿菌是最主要的腐敗菌，且兩種菌都在儲(chǔ)藏過(guò)程中呈明顯上升趨勢(shì)。葡萄球菌數(shù)量相對(duì)較少，呈先上升后下降趨勢(shì)。這些工作為進(jìn)一步探討米發(fā)糕保存技術(shù)、建立有效的防腐提供了新的思路。

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Microbial Analysis of Fermented Rice Cake during Storage

CHEN Fang-rong，XU Xiao-yun，ZHANG Min，PAN Si-yi，LI Xiu-juan*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Fermented rice cake is a kind of traditional fermented food in China, especially in southern areas. In this study, the microbial analysis of fermented rice cake during storage was conducted, and the bacterial strains were identified by sequencing of partial 16S rDNA through polymerase chain reaction (PCR) amplification. The results indicated that bacteria were the major factor for the spoilage of fermented rice cake. Three major kinds of bacteria were isolated, purified and identified as Lactobacillus fermentum, Staphylococcus pasteuri and Bacillus cereus. Moreover, Lactobacillus and Bacillus were identified as the dominant spoilage bacteria through the microbial analysis, and both of them revealed an obvious increase trend with the extension of storage time.

fermented rice cake；microbe；isolation；identification；dominant spoilage bacteria

TQ929.2

A

1002-6630(2011)03-0186-05

2010-05-12

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2007620)

陳芳溶(1984-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：fangrong19@yahoo.com.cn

*通信作者：李秀娟(1978—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全、農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：lixiujuan@mail.hzau.edu.cn