劉 韓，關(guān) 宏，楊文欽，張 琪，韓明宇，劉吉成*

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

凝固型酸奶作為一種集營(yíng)養(yǎng)、保健、味美于一體的復(fù)合型酸奶，其研制和開發(fā)對(duì)擴(kuò)大酸奶制品在整個(gè)乳制品行業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力，具有一定的積極作用[1]。近幾年，酸奶在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的銷售量日益增長(zhǎng)，并已從大城市迅速發(fā)展到中小城市，因此，開發(fā)多種類型的酸奶制品勢(shì)在必行[2]。凝固型酸奶對(duì)原料要求高，加工過程中一般不添加食品添加劑，其中乳酸菌活菌數(shù)和蛋白質(zhì)含量較高，具有增強(qiáng)免疫功能、調(diào)節(jié)血脂和胃腸道微生態(tài)平衡、保護(hù)肝臟、防癌抗癌抗衰老等多方面調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和營(yíng)養(yǎng)保健作用的一種良好乳制品[3-4]。

雙歧桿菌是健康個(gè)體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)宿主發(fā)揮生物屏障、營(yíng)養(yǎng)、免疫、抗腫瘤、改善人體代謝等多種生理作用，基于雙歧桿菌的重要生理功能和人體健康的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外多種食品與醫(yī)藥雙歧桿菌微生態(tài)制劑相繼問世，品種已達(dá)70多種[5-8]。在含雙歧桿菌的食品制劑中，只有當(dāng)雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)到106cfu·mL-1以上，才能起到益生菌的生理功效，因此，研究簡(jiǎn)便易行的雙歧桿菌選擇計(jì)數(shù)方法至關(guān)重要，文獻(xiàn)報(bào)道通過在MRS培養(yǎng)基中添加抗生素、替換培養(yǎng)基碳源和添加顯色底物等方法可以對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)，如NPNL-MRS、OGMRS、LP-MRS、Bile-MRS、NNL-MRS、XGal-MRS、MRS-raffinose培養(yǎng)基等[9-14]。

本研究結(jié)合牛奶和青春雙歧桿菌對(duì)人體的有益作用，研究出具有獨(dú)特風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)保健的青春雙歧桿菌凝固型酸奶；比較幾種培養(yǎng)基對(duì)三種發(fā)酵劑以及青春雙歧桿菌凝固型酸奶活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，解決了保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和青春雙歧桿菌同時(shí)存在條件下青春雙歧桿菌活菌計(jì)數(shù)問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鮮牛奶、白砂糖。

1.1.2 菌種

保加利亞乳桿菌23402（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus,LB）、嗜熱鏈球菌23502（Streptococcus thermophilus，STR）、青春雙歧桿菌23001（Bifidobacteria adolescentic，BA）均保藏于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)推廣中心。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

MRS培養(yǎng)基、Bile-MRS培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加牛膽汁粉1.5 g·L-1）、XGal-MRS培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖100μmol·L-1）、LP-MRS 培 養(yǎng) 基（Lithium Propionate MRS,MRS培養(yǎng)基中添加氯化鋰4 g·L-1和丙酸鈉6 g·L-1）和LM-MRS培養(yǎng)基（Lithium Mupirocin MRS,MRS培養(yǎng)基中添加莫匹羅星鋰鹽50 mg·L-1）[9-14]。

1.1.4 儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱（美國(guó)SHEL LAB公司）；高壓蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50A）（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；顯微鏡（CX31）（日本奧林巴斯公司）；高壓均質(zhì)機(jī)（SLS-60-70）（上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；海爾冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 青春雙歧桿菌凝固型酸奶的制備及品質(zhì)檢測(cè)

1.2.1.1 發(fā)酵劑的制備

在厭氧條件下，利用MRS培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌凍存菌種進(jìn)行復(fù)蘇后，將其接種到青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3～4次[15]，4℃冰箱保存作為青春雙歧桿菌發(fā)酵劑；利用MRS培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌凍存菌種進(jìn)行復(fù)蘇后，將其接種到10%脫脂乳中連續(xù)傳代3～4次，4℃冰箱保存作為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑。

1.2.1.2 生產(chǎn)工藝流程

鮮乳→凈化→配料→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→灌裝→發(fā)酵

1.2.1.3 青春雙歧桿菌凝固型酸奶生產(chǎn)工藝確定

白砂糖添加量、接種量、菌種比例和發(fā)酵時(shí)間是影響青春雙歧桿菌凝固型酸奶感官品質(zhì)的主要因素，通過正交試驗(yàn)以感官評(píng)價(jià)作為標(biāo)準(zhǔn)選擇出青春雙歧桿菌凝固型酸奶的最佳生產(chǎn)工藝[16]。正交因素水平見表1。

表1 正交因素水平Table1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.1.4 檢測(cè)方法

感官評(píng)價(jià):選擇齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)推廣中心5名教師，于飯后2 h進(jìn)行品嘗，品嘗前漱口。感官評(píng)定內(nèi)容以顏色、組織狀態(tài)、凝固狀態(tài)、是否有乳清析出和口感為評(píng)分指標(biāo)。每項(xiàng)指標(biāo)由5人評(píng)分，取其平均值，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

滴定酸度:按GB 5413.34-2010方法測(cè)定（°T）。

理化指標(biāo):蛋白質(zhì)參照GB 5009.5-2010、脂肪參照GB 5009.46-2010、非脂乳固體參照GB 5413.39-2010方法測(cè)定。

微生物指標(biāo):大腸菌群參照GB 4789.3-2010、沙門氏菌參照GB4789.4-2010、金黃色葡萄球菌參照GB 4789.10-2010、霉菌和酵母菌參照GB4789.15-2010、乳酸菌參照GB 4789.35-2010方法檢測(cè)。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory rating criteria

1.2.2 選擇性培養(yǎng)基比較

1.2.2.1 三種發(fā)酵劑在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況的比較

使用MRS培養(yǎng)基、Bile-MRS培養(yǎng)基、LMMRS培養(yǎng)基、XGal-MRS培養(yǎng)基和LP-MRS培養(yǎng)基，采用平板菌落計(jì)數(shù)法分別對(duì)保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑、嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑、青春雙歧桿菌發(fā)酵劑三個(gè)樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2.2 青春雙歧桿菌凝固型酸奶中三種乳酸菌計(jì)數(shù)

結(jié)合MRS培養(yǎng)基和LM-MRS培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌凝固型酸奶進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，建立分別檢測(cè)三種乳酸菌活菌數(shù)的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 青春雙歧桿菌凝固型酸奶生產(chǎn)工藝的確定

本試驗(yàn)采用直觀分析方法，對(duì)表3中各因素K值及R值的大小進(jìn)行比較，由極差R得知C＞D＞B＞A，說明發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響較大，其次是菌種比例，然后是接種量和白砂糖添加量。從K值可以看出青春雙歧桿菌凝固型酸奶最佳生產(chǎn)工藝為A3B2C2D2。即，白砂糖添加量為8%、接種量3%、LB∶STR∶BA=1∶1∶4、培養(yǎng)4 h。產(chǎn)品酸甜適中、無(wú)乳清析出且凝固狀態(tài)及細(xì)膩度極佳。

表3 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and results of optimization of fermentation parameters

2.2 青春雙歧桿菌凝固型酸奶質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 理化指標(biāo)檢測(cè)

青春雙歧桿菌凝固型酸奶理化指標(biāo):蛋白質(zhì)2.9%，脂肪3.2%，非脂乳固體12.9%，滴定酸度110°。

2.2.2 微生物指標(biāo)檢測(cè)

青春雙歧桿菌凝固型酸奶微生物指標(biāo):乳酸菌1.65×109cfu·mL-1，未檢出大腸菌群，未檢出致病菌，未檢出霉菌及酵母菌。

2.3 選擇性培養(yǎng)基的比較結(jié)果

由表4可知，三種乳酸菌均可在MRS培養(yǎng)基和XGal-MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且活菌數(shù)無(wú)明顯差別；Bile-MRS培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌有明顯的抑制作用，對(duì)嗜熱鏈球菌和青春雙歧桿菌無(wú)抑制作用；LP-MRS培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌無(wú)抑制作用，對(duì)保加利亞乳桿菌有明顯的抑制作用，對(duì)嗜熱鏈球菌有一定的抑制作用，當(dāng)嗜熱鏈球菌濃度低時(shí)抑制作用明顯，當(dāng)嗜熱鏈球菌濃度高時(shí)抑制作用減弱；三種乳酸菌在XGal-MRS培養(yǎng)基均形成藍(lán)色菌落，無(wú)法從菌落顏色上區(qū)分三種乳酸菌；LM-MRS培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌有明顯的抑制作用，對(duì)青春雙歧桿菌無(wú)抑制作用，平板照片見彩版Ⅰ。

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在MRS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)有明顯差異，保加利亞乳桿菌菌落較大且邊緣不整齊、嗜熱鏈球菌菌落較小且邊緣整齊，兩種菌落形態(tài)差異在培養(yǎng)48 h時(shí)比培養(yǎng)24 h時(shí)明顯，見彩版Ⅱ。

表4 三種發(fā)酵劑在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table4 Three kinds of culture in different media on the growth situation （lg cfu·mL-1）

2.4 青春雙歧桿菌凝固型酸奶中青春雙歧桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

通過上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LM-MRS培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌有明顯的抑制作用，因此選擇LM-MRS培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌凝固型酸奶中青春雙歧桿菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并且在平板上隨機(jī)挑取20個(gè)菌落鏡檢驗(yàn)證。青春雙歧桿菌凝固型酸奶中青春雙歧桿菌活菌數(shù)為2.0×106cfu·mL-1。

2.5 青春雙歧桿菌凝固型酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

利用MRS培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌凝固型酸奶進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，大菌落且邊緣不整齊為保加利亞乳桿菌、小菌落且邊緣整齊為嗜熱鏈球菌，并且在平板上隨機(jī)挑取20個(gè)大菌落和20個(gè)小菌落鏡檢驗(yàn)證。青春雙歧桿菌凝固型酸奶中保加利亞乳桿菌活菌數(shù)為8.0×108cfu·mL-1，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)為8.5×108cfu·mL-1（見彩版Ⅱ）。

3 討論

本研究通過對(duì)幾種選擇培養(yǎng)基的比較發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和青春雙歧桿菌均可在MRS培養(yǎng)基和XGal-MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，活菌數(shù)無(wú)明顯差別，并且三種乳酸菌在XGal-MRS培養(yǎng)基均形成藍(lán)色菌落，無(wú)法使用XGal-MRS培養(yǎng)基從菌落顏色上區(qū)分三種乳酸菌，原因是由于三種乳酸菌的α-半乳糖苷酶均可分解XGal-MRS培養(yǎng)基中的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖，釋放出吲哚產(chǎn)生藍(lán)色菌落；Bile-MRS培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌有明顯的抑制作用，對(duì)嗜熱鏈球菌和青春雙歧桿菌無(wú)抑制作用；LP-MRS培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌無(wú)抑制作用，對(duì)保加利亞乳桿菌有明顯的抑制作用，對(duì)嗜熱鏈球菌有一定的抑制作用，當(dāng)嗜熱鏈球菌濃度低時(shí)抑制作用明顯，當(dāng)嗜熱鏈球菌濃度高時(shí)抑制作用減弱；LM-MRS培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌有明顯的抑制作用，對(duì)青春雙歧桿菌無(wú)抑制作用。在保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和青春雙歧桿菌同時(shí)存在的條件下，LM-MRS培養(yǎng)基是一種很好的青春雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基。當(dāng)樣品中同時(shí)含有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌時(shí)，使用MRS培養(yǎng)基可以通過菌落形態(tài)來(lái)區(qū)分這兩種乳酸菌，菌落大且邊緣不整齊的為保加利亞乳桿菌、菌落小且邊緣整齊的為嗜熱鏈球菌。

4 結(jié)論

通過試驗(yàn)確定了青春雙歧桿菌凝固型酸奶最佳工藝為白砂糖8%，接種量3%，保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶青春雙歧桿菌=1∶1∶4，發(fā)酵4 h。結(jié)合MRS培養(yǎng)基和LM-MRS培養(yǎng)基可以對(duì)青春雙歧桿菌凝固型酸奶中三種乳酸菌分別菌落計(jì)數(shù)，青春雙歧桿菌凝固型酸奶中保加利亞乳桿菌活菌數(shù)為8.0×108cfu·mL-1，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)為8.5×108cfu·mL-1，青春雙歧桿菌活菌數(shù)為2.0×106cfu·mL-1。

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