李佩珊，張春燕，李時君，陳妍，項美娟，李方和，張洪

(1.武漢大學第一臨床學院藥劑科，430060;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院實驗醫(yī)學研究中心，武漢 430030)

莢膜多糖是細菌類疫苗(如腦炎球菌疫苗等)制備的重要物質(zhì)之一，其抗體，尤其是單克隆抗體的研制是推動產(chǎn)品(診斷、分型及其抗體治療產(chǎn)品)質(zhì)量評價及其疫苗接種效果監(jiān)測的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［1-2］。由于分子結(jié)構(gòu)簡單且抗原性弱，此類多糖疫苗對相應疾病預防的效果欠佳，對應抗體尤其是單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的制備亦因而受到較大的影響［3-4］。鑒于與載體(蛋白)的耦聯(lián)能顯著提升此類物質(zhì)的免疫特性［5］，筆者所在單位曾進行A群奈瑟腦膜炎球菌莢膜多糖(Neisseria meningococcal serogroup A polysaccharide，GAMP)-破傷風類毒素(tetanus toxoid，TT)耦聯(lián)物制備的研究。為方便對該制劑進行質(zhì)量控制與生產(chǎn)監(jiān)測，筆者在此基礎(chǔ)上進行了抗GAMP單克隆抗體(抗GAMP mAb)制備，并對其相關(guān)特征進行了考核，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Sp2/0細胞由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供;RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑等購自Gibco公司;聚乙二醇4000，次黃嘌呤(hypoxathine，H)、氨蝶呤(aminopterin，A)、胸苷(thymidine，T)、小鼠免疫球蛋白亞類檢測試劑、羊抗鼠IgG(GAM)及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗鼠 IgG(GAM-HRP)，以及HRP等購自Sigma公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)試劑盒購自美國Pierce公司;染色體分析試劑(秋水仙素等)由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院遺傳學實驗室饋贈;純化GAMP抗原、TT、GAMPTT、基因重組乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)以及氫氧化鋁［Al(OH)3］凝膠與BALB/c小鼠等由武漢生物制品研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物免疫 取 GAMP及 GAMP-TT各適量(50 μg·mL-1)，加等體積弗氏完全佐劑混合，乳化后分別于實驗組與對照組(每組15只，雌性，6～8周齡)BALB/c小鼠背部皮下作多點注射，每只小鼠每次注射 0.2 mL(5.0 μg)。2 周后取同上抗原，加等體積弗氏不完全佐劑乳化，背部皮下多點注射;間隔2周同上法做加強免疫共3次。于各次免疫后10 d采血，分離血清置－20℃凍存。

另取BALB/c小鼠1只，同上法以GAMP-TT結(jié)合物進行免疫，末次加強免疫改為以相同劑量抗原做腹腔注射，3 d后摘取脾臟做細胞融合。

1.2.2 雜交瘤細胞建株 采用常規(guī)聚乙二醇法融合，以有限稀釋法進行克隆化，具體操作見文獻［6］。

1.2.3 單克隆抗體的篩選 抗GAMP mAb的篩選與效價檢測采用間接酶聯(lián)免疫吸附法。主要實驗步驟為采用GAMP(融合篩選)或GAMP-TT(克隆化篩選與效價滴定)包被酶標反應板(4℃放置過夜)，加入被篩選培養(yǎng)上清液反應(室溫放置30 min)并洗滌，加入酶標記羊抗鼠IgG反應(室溫放置30 min)并洗滌，以及加入HRP底物系統(tǒng)顯色及其結(jié)果判讀等。具體操作參照文獻及本室常規(guī)［6］。

1.2.4 抗GAMP mAb的制備 抗GAMP mAb雜交瘤腹腔積液的制備采用降植烷誘導法;純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法;腹腔積液及純化產(chǎn)物蛋白含量檢測采用紫外比色法;產(chǎn)物純度的鑒定采用Western blot;純化產(chǎn)物的辣根過氧化物酶標記采用改良過碘酸鹽氧化法。上述實驗的具體操作按本室常規(guī)并參考相關(guān)文獻。

1.2.5 雜交瘤細胞染色體鑒定 加入秋水仙素作阻斷培養(yǎng)，以低滲法處理后制備標本滴片，染色，計數(shù)約50個染色體分布均勻而完整的雜交瘤細胞，并計算其染色體數(shù)目均值。

1.2.6 抗GAMP mAb的特異性鑒定 抗原替代實驗與抗原中和實驗參照既往文獻報道［7］。具體操作如下，抗原替代實驗:①以抗GAMP 2E7 mAb包被酶標反應板;②將GAMP及其他幾種不同替代抗原稀釋至5.0 μg·mL-1，加至各包被板各相應反應孔中，每一抗原加5孔，室溫反應45 min，常規(guī)洗滌5次;③加入適宜濃度的抗GAMP mAb-HRP，室溫反應45 min，常規(guī)洗滌5次;④按常規(guī)完成剩余酶聯(lián)免疫吸附法操作。抗原中和實驗:①以GAMP-TT包被酶標反應板;②根據(jù)預實驗結(jié)果，將抗GAMP mAb-HRP稀釋成2倍最適酶聯(lián)免疫吸附濃度;③將幾種不同中和抗原調(diào)整至相同的基礎(chǔ)濃度(2.0 mg·mL-1)，并按表3做系列稀釋;④在各抗原稀釋孔中分別加入等體積抗GAMP mAb-HRP，置室溫30 min;⑤將中和反應后的標本加入各相應的包被孔中;按常規(guī)完成剩余酶聯(lián)免疫吸附法操作。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 免疫原的評價與選擇 采用GAMP-TT與GAMP對兩組BALB/c小鼠進行免疫，以間接ELISA(GAMP包被)對其抗GAMP進行檢測，并對兩者免疫效果(幾何平均效價)進行比較。實驗結(jié)果見表1。根據(jù)表1結(jié)果，選擇GAMP-TT作抗原，同法免疫用以制備抗GAMP mAb。

2.2 雜交瘤細胞株的建立

2.2.1 融合與雜交瘤細胞篩選 采用常規(guī)聚乙二醇法融合，間接酶聯(lián)免疫吸附法作抗GAMP mAb篩選，經(jīng)3次克隆化后獲得1株分泌抗GAMP mAb的雜交瘤細胞(2E7)。不同時段該雜交瘤細胞的生長與分泌狀況見表2。

2.2.2 腹腔積液制備及檢測 將雜交瘤細胞調(diào)整至1×107·mL-1，將其注射到5只預先用降植烷處理過的BALB/c小鼠腹腔中，于接種后11～14 d分別采取腹腔積液，1500 r·min-1(r=17.9 cm)離心 10 min，取中層液體混合后分裝，置－20℃凍存。5只小鼠腹腔積液采集量3.7～8.1 mL(平均5.42 mL);混合抗體腹腔積液總蛋白23.50 g·L-1;混合腹腔積液抗GAMP效價為1×10-8(間接酶聯(lián)免疫吸附法)。

表1 2種不同抗原對BALB/c小鼠的免疫效果Tab.1 Results of BALB/c mice immunized with two different antigens

表1 2種不同抗原對BALB/c小鼠的免疫效果Tab.1 Results of BALB/c mice immunized with two different antigens

與對照組比較，*1P ＞0.05，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＞0.05，*2P ＜0.01

表2 抗GAMP 2E7雜交瘤細胞的融合、克隆化及篩選Tab.2 Results of fusing，cloning and screening of anti-GAMP 2E7 hybridoma cells

2.3 雜交瘤細胞的染色體鑒定 采用秋水仙素阻斷法對經(jīng)3次克隆化后的2E7雜交瘤細胞做染色體計數(shù)檢測，染色結(jié)果見圖1。隨機選取45個溶脹充分、染色體分布均勻的細胞進行計數(shù)，染色體數(shù)量在137～145 條之間，平均染色體數(shù)(139.73 ±2.16)條。

圖1 抗GAMP mAb分泌2E7雜交瘤細胞的染色體檢測Fig.1 Chromatic picture of 2E7 hybridoma cell that secreted anti-GAMP mAb

2.4 單抗的純化與鑒定

2.4.1 單克隆抗體的純化 取上述2E7雜交瘤細胞誘生的小鼠腹腔積液3.0 mL，以辛酸-硫酸銨沉淀法純化;紫外比色法［以牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為參比］測定其純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的含量。前后兩次提取物 IgG濃度分別為1.76和2.32 mg·mL-1。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對其進行檢測，抗 GAMP 效價分別為2.56 ×106及5.12 ×106。

2.4.2 純化產(chǎn)物的標記 采用改良過碘酸鹽法對2E7 mAb提取產(chǎn)物做HRP標記，標記產(chǎn)物經(jīng)鹽析并透析后加甘油至40%，置－20℃凍存。采用直接酶聯(lián)免疫吸附法進行測定，其標記產(chǎn)物效價為1/25600 。

取上述標記產(chǎn)物(抗GAMP mAb HRP)適量，采用40% 丙三醇將其稀釋至效價為1/200，適量分裝置－20℃凍存，臨用時稀釋。

2.4.3 產(chǎn)物純度鑒定 采用SDS-PAGE對提取物進行進行鑒定，實驗結(jié)果(圖2)顯示，提取物經(jīng)SDS PAGE后顯示兩條染色區(qū)帶，其相對分子質(zhì)量分別約為75000 及45000 ，灰度掃描分析顯示其純度為97.6%。

圖2 純化抗GAMP E7 mAb純度的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purity of anti-GAMP E7 mAb

2.4.4 抗GAMP 2E7 mAb的Ig亞類鑒定 采用膠體金免疫層析實驗對抗GAMP 2E7培養(yǎng)上清液中Ig的類型與亞類進行鑒定，結(jié)果顯示該雜交瘤細胞所分泌的抗體屬IgG，其亞類為IgG1。

2.4.5 抗GAMP 2E7 mAb的特異性考核

2.4.5.1 抗原中和實驗 采用前述方法做抗原替代實驗，實驗結(jié)果見表3［以中和孔吸光度值(A)/中和率(%)表示］。兩種A群流腦菌多糖中和孔當抗原濃度在0.10 μg·mL-1時出現(xiàn)明顯中和效果(中和率 ＞50.0%)，抗原濃度在10.00 μg·mL-1時基本達到完全中和。其余抗原替代孔中和反應呈陰性。

2.4.6 抗原替代實驗 采用前述方法做抗原替代實驗，分別采用 GAMP-TT、GAMP、TT、HBsAg、BSA 包被，各反應孔顯色強度(A450)分別為2.67 ±0.065，2.04 ±0.132，0.045 ±0.043，0.032 ± 0.029，0.029 ± 0.031。可見，采用GAMP與GAMP-TT進行包被，各反應孔均呈陽性顯色反應，但其顯色強度(A450)以采用GAMPTT者為高，顯色的可重復性亦明顯高于采用GAMP包被孔。單純TT包被及采用無關(guān)抗原包被組各反應孔未顯示明確的陽性信號，其顯示強度分別與GAMP及GAMP-TT兩組相比均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表3 抗GAMP 2E7 mAb特異性考核抗原中和實驗結(jié)果Tab.3 Result of specificity identification using neutralization assay that conjugated anti-GAMP 2E7 mAb

3 討論

與普通多態(tài)性抗原相比，純化后的細菌莢膜多糖在抗原性上存在較多缺陷［1-2］，通過與適當載體的結(jié)合，其免疫特征能得到極大改善［3-4］。這一現(xiàn)象作為疫苗制劑學中的一項重要發(fā)現(xiàn)，已被用于多種細菌多糖疫苗的制備，將其用于A群流腦菌多糖結(jié)合疫苗、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗等疫苗的研制及其臨床應用，取得理想的預防效果［1-2］。采用結(jié)合多糖(如GAMP-TT)包被酶標反應板，所制備試劑對相應抗體檢測的穩(wěn)定性大幅提高［8］。鑒于相應抗體(尤其是單克隆抗體)的制備與研究同樣受多糖自身免疫缺陷的制約［4］，筆者以抗GAMP mAb的研制為契機，對載體結(jié)合多糖在單克隆抗體制備中的應用特征進行了探討。實驗結(jié)果顯示，在相同的實驗條件下采用GAMP與GAMP-TT對一組BALB/c小鼠做對比免疫，后者的免疫效果較前者升高超過一個數(shù)量級，為采用結(jié)合多糖做免疫原制備單克隆抗體提供了選擇依據(jù)。采用GAMP-TT免疫BALB/c小鼠，經(jīng)常規(guī)融合及篩選，獲得一株分泌抗GAMP mAb的雜交瘤細胞(2E7)。采用既往報道的方法制備小鼠腹腔積液，純化mAb IgG，并對純化產(chǎn)物進行標記(HRP)，其腹腔積液誘生產(chǎn)量、提取物純度以及標記抗體的效價等與既往單克隆抗體研究結(jié)果大致相同。采用中和及抗原取代酶聯(lián)免疫吸附法對上述制備物進行考核，初步證實2E7 mAb對GAMP的結(jié)合具有良好的特異性。

單克隆抗體技術(shù)發(fā)端于20世紀70年代中期，其應用已十分普及。然而作為一種大分子弱抗原，細菌莢膜多糖mAb的制備往往需要借助某些新的實驗手段［4，8］。采用多糖-蛋白耦聯(lián)物以矯正并提高多糖的免疫原性是新近研究者所熱衷的主要手段之一。然而影響多糖-蛋白偶聯(lián)物免疫原性的因素至少包括多糖分子大小，載體蛋白的種類，多糖、蛋白耦聯(lián)度，耦聯(lián)劑(或稱間隔基)的種類，耦聯(lián)方法及其耦聯(lián)條件的優(yōu)化等［4］。筆者采用GAMP-TT耦聯(lián)物進行免疫，實驗動物免疫狀態(tài)較佳，并獲得一株具有較好分泌特征的mAb細胞株。但該細胞株在融合及其早期克隆化過程中的狀態(tài)并不盡如人意，染色體檢測表現(xiàn)出明確的多細胞融合證據(jù)。盡管經(jīng)反復的克隆化與適應性培養(yǎng)而獲得了具有穩(wěn)定增殖與分泌特征的雜交瘤細胞株［9］，但這一現(xiàn)象是否多見于此類特殊制備，即采用結(jié)合多糖免疫制備單克隆抗體的方法仍有待進一步實驗證實。

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