王之梅 袁宏佳 萬鵬 張家繼

1 重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院（重慶400700）

2 重慶市中醫(yī)院（重慶400021）

止嗽退熱合劑臨床用于以發(fā)熱、咳嗽為主要表現(xiàn)的流行性感冒和普通感冒，對急性上呼吸道感染性疾病初期有防治效果。清熱解毒藥金銀花、連翹均有廣譜抗菌、抗病毒作用，但臨床存在血藥濃度不高的問題。為此，在中醫(yī)理論“辨病與辨證”相結(jié)合的原則下，為改進(jìn)辛涼解表劑的組方設(shè)計(jì)、提高整體和病灶區(qū)藥物濃度，本實(shí)驗(yàn)采用二步提取法改進(jìn)傳統(tǒng)湯劑的煎煮易揮發(fā)散失部分有效成分、有些成分又不易煎出、質(zhì)量不穩(wěn)定、口服量大、不宜批量生產(chǎn)諸多問題。本試驗(yàn)考察二步提取法工藝并對有效成分進(jìn)行薄層色譜（TLC）鑒別。

1 提取工藝

1.1 材料止嗽退熱合劑（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院提供），主要藥材：金銀花、連翹、荊芥、牛蒡子、淡豆豉、薄荷、蘆竹根、淡竹葉、生地黃、麥冬、浙貝母、桔梗、僵蠶、苦杏仁、川射干、甘草、桔梗。藥材均由重慶中藥材公司提供，按2010年版《中國藥典》［1］及《重慶市中藥飲片炮制規(guī)范》鑒定。

1.2 提取方法 組方中君藥為金銀花和連翹，其主要有效成分為綠原酸，故以綠原酸為正交試驗(yàn)的主要評價(jià)指標(biāo)，以處方藥材投料量及浸膏收得率為參考評價(jià)指標(biāo)。組方中除荊芥、連翹、牛蒡子含有效揮發(fā)性成分外，其余各藥材有效部位（成分）均以水溶性為主，故先用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性成分，再與方中各藥材一起以水為溶媒進(jìn)行提取，以正交試驗(yàn)法確定水提取的最佳提取工藝，按L9（34）正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)。

1.3 因素水平以對有效成分溶出量影響較大的3個(gè)因素，即提取時(shí)間（A）、煎煮次數(shù)（B）、加水倍數(shù)（C）為考察因素，選用L9（34）正交試驗(yàn)對其進(jìn)行了優(yōu)化研究，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)際，每因素選擇3個(gè)水平，提取工藝因素水平見表1。

1.4 正交試驗(yàn)按處方比例稱取各味藥材，共9份，其中連翹、荊芥、牛蒡子先提取揮發(fā)性成分后，再加入余下藥材，合并進(jìn)行水提取，按照L9（34）正交試驗(yàn)表安排的因素水平條件進(jìn)行煎煮，煎煮后與蒸餾液提取后的水溶液合并，濃縮加入薄荷腦乙醇溶液制成樣品。結(jié)果 因素A、B、C均對浸膏得率有顯著影響（P＜0.05），影響順序?yàn)锽＞A＞C，由表2可知，各因素不同水平對浸膏得率的影響順序?yàn)?，A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1。綜合以上分析，考慮生產(chǎn)實(shí)際，初步確定最佳工藝條件為A3B2C2，即提取時(shí)間為2h，加8倍水，煎煮2次。

表2 水提取工藝正交試驗(yàn)表

表3 水提取工藝正交試驗(yàn)方差分析表

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)將處方中各味藥材按處方比例，以相當(dāng)于藥材量8倍的水，提取2次，每次提取2h，將提取液過濾、濃縮。測定浸膏含量，計(jì)算出浸膏得率，共進(jìn)行3次試驗(yàn)。結(jié)果 與正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果 基本吻合，說明正交試驗(yàn)選出的工藝條件合理，工藝條件穩(wěn)定可行。水提取工藝確定提取的最佳條件為A3B2C2，即以8倍水，提取2次，每次提取2h。提取條件為≤溫度90℃，冷卻水溫≤40℃。

表1 因素水平表

表4 提取工藝重復(fù)試驗(yàn)表

2 質(zhì)量控制

2.1 材料止嗽退熱合劑（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院提供）。綠原酸對照品、荊芥對照藥材、浙貝母對照藥材（均購自中國藥品生物制品檢定所）。乙酸乙酯、甲酸、乙醇、石油醚（60～90℃）、正己烷、硫酸、氨水、氯仿均為分析純，香草醛、碘化鉍鉀。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；定量點(diǎn)樣毛細(xì)管；MA110型電子天平（上海天平儀器廠）。

2.2 相對密度、pH及微生物限度檢查性狀：本品為棕黃色液體，久置有少量沉淀；味甘、微苦、略有清涼感。相對密度：按照文獻(xiàn)［1］方法 測定，結(jié)果 見表5。微生物限度檢查：根據(jù)文獻(xiàn)［1］方法 進(jìn)行檢查，結(jié)果 見表6。

表5 相對密度與pH測定結(jié)果

表6 微生物限度檢查（cfu/mL）

2.3 金銀花TLC鑒別

2.3.1 溶液制備取本品30mL，水浴蒸干，殘?jiān)右掖既芙?，過濾，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。取綠原酸對照品，制成每1mL含有1mg的乙醇溶液，作為對照品溶液。取缺金銀花的樣品30mL，按照供試品溶液制備方法 制成金銀花陰性樣品溶液。2.3.2TLC按照文獻(xiàn)［1］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（10∶2∶3）的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm熒光下觀察。結(jié)果 供試品溶液與對照品溶液在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品溶液在此處無斑點(diǎn)。表明本法可將綠原酸與其他成分較好的分離，靈敏度高，專屬性好。

2.4 荊芥TLC鑒別

2.3.1 溶液制備取本品10mL，加石油醚（60～90℃）20mL，密塞，振搖，并放置過夜，濾過，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。取荊芥對照藥材1g，同法制成對照品溶液。取缺荊芥的樣品10mL，按照供試品溶液制備方法 制成荊芥陰性樣品溶液。

2.3.2 TLC按照文獻(xiàn)［1］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛5%硫酸乙醇液，105℃烘烤至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果 供試品溶液與對照品溶液在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品溶液在此處無斑點(diǎn)。表明本法可將荊芥藥材與其他藥材較好的分離，靈敏度高，專屬性好。

2.5 浙貝母TLC鑒別

2.5.1 溶液制備取本品30mL，加氨水調(diào)節(jié)pH＞10，氯仿提取2次，每次25mL，分取氯仿層，蒸干，殘?jiān)?mL氯仿溶解，作為供試品溶液。取浙貝母對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。取缺浙貝母的樣品30mL，按照供試品溶液制備方法 制成陰性樣品溶液。

2.5.2 TLC按照文獻(xiàn)［1］試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各10μL，對照藥材溶液6μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。結(jié)果 供試品溶液與對照品溶液在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性樣品溶液在此處無斑點(diǎn)。表明本法可將浙貝母藥材與其他藥材較好的分離，靈敏度高，專屬性好。

圖1 金銀花（綠原酸）

圖2 荊芥

圖3 浙貝母

3 討論

止嗽退熱合劑方中連翹、牛蒡子、荊芥含揮發(fā)性成分，其余十二味藥（薄荷腦除外）的主要有效成分均為水溶性，所以先用水蒸氣蒸餾法提取3味揮發(fā)性成分，藥渣再與余下的12味藥用水提取，簡稱為“二步提取法”。止嗽退熱合劑的主效藥物成分的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性是提取工藝設(shè)計(jì)參考的主要依據(jù)。君藥金銀花、連翹清熱解毒的主效成分為綠原酸、異綠原酸、木犀草素及連翹酚等均溶于水，在水提取升溫過程中，金銀花中的多酚氧化酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)綠原酸氧化縮合反應(yīng)；當(dāng)水溫上升達(dá)90℃以上，綠原酸分解加速［2］。組方中薄荷的主效成分薄荷腦為揮發(fā)性成分，熔點(diǎn)24～44℃，蒸餾提取時(shí)易隨蒸餾液的冷卻而析出流失，組方以薄荷腦代替薄荷既經(jīng)濟(jì)又保證了制劑中藥物有效濃度，利于病灶區(qū)黏膜的吸收。

為了保證止嗽退熱合劑的內(nèi)在質(zhì)量和穩(wěn)定性，合劑的調(diào)配技術(shù)極為關(guān)鍵。采用連續(xù)循環(huán)攪拌混合法，先將水提取的濃縮液置立式圓柱攪拌罐內(nèi)，在循環(huán)攪拌狀態(tài)下，用導(dǎo)管緩緩加入含揮發(fā)性成分的蒸餾液，再用噴槍將薄荷腦的95%乙醇溶液（1∶1.5）噴入罐內(nèi)，再連續(xù)循環(huán)攪拌5～10min，以保證各組分分布均勻。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄ⅦG，附錄ⅫC，附錄ⅣB.

［2］ 王天志.金銀花的研究進(jìn)展［J］.華西醫(yī)學(xué)雜志，2000，15（4）：292-298.