夏小樂，朱小明，張斌，夏梅芳，楊海麟，趙慧，沈蒙蒙，王武

1(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)2(南通如皋白蒲水明樓黃酒有限公司，江蘇如皋，226500)

黃酒是中國獨(dú)有的酒種，按照含糖量多少和發(fā)酵工藝，可分為干型、半干型、半甜型、甜型［1］。它具有低酒精度、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。

黃酒的傳統(tǒng)釀造是采用多菌種，邊糖化、邊發(fā)酵的三邊工藝，除產(chǎn)生乙醇、功能寡肽和大量各類香氣物質(zhì)外，還會(huì)產(chǎn)生一些不利人體健康的物質(zhì)，典型的如過量的雜醇油、甲醇、醛類和游離的嘌呤類物質(zhì)等，這些有害物質(zhì)在一定程度上影響了黃酒的飲用和發(fā)展。黃酒飲用后相較其他酒而言普遍反映有易上頭、易醉和嚴(yán)重的“后反功”，而造成黃酒上頭的主要物質(zhì)是過量的雜醇油。雜醇油是一類高沸點(diǎn)的混合物，是淡黃色至棕褐色的透明液體，是3個(gè)碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，其主要成分是正丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、戊醇、異戊醇、活性戊醇、辛醇、苯乙醇、色醇、酪醇等高級(jí)醇［2－3］;它們?cè)邳S酒中普遍存在，其在黃酒中正常的生成和合理存在無疑對(duì)酒質(zhì)呈香呈味有積極作用，但是過量就會(huì)影響酒質(zhì)和對(duì)人體產(chǎn)生危害［7］。雜醇油生成機(jī)制被認(rèn)為主要通過Ehlrich途徑和糖合成途徑形成中間產(chǎn)物α-酮基酸，繼而產(chǎn)生雜醇油［5］。國內(nèi)外對(duì)雜醇油有較多報(bào)道，己經(jīng)證實(shí)飲酒上頭與雜醇油含量直接相關(guān)，一些酒類標(biāo)準(zhǔn)也對(duì)雜醇油含量進(jìn)行了限制［6］。

殷德榮等采用氣相色譜法測(cè)定紹興黃酒中正丙醇含量為 128．1 mg/L，異丁醇 118．7 mg/L，異戊醇284．5 mg/L［7］; 郭 翔 等［8］利 用 固 相 微 萃 取 技 術(shù)(SPME)結(jié)合GC-MS測(cè)定半干型黃酒中醇和酯，其中丙醇為3．3 ～16．3mg/L，異丁醇45．1 ～150．6 mg/L，異戊醇 162．3 ～295．5 mg/L;夏小樂等［9］等利用外標(biāo)氣相色譜法測(cè)定了清爽型黃酒中的乙醛和雜醇油含量，乙醛含量達(dá)到40．5 mg/L，雜醇油達(dá)到38．3 mg/100mL。上述研究均未涉及黃酒類型和工藝間的差異，未能全面深入的對(duì)雜醇油的含量和生成因素進(jìn)行分析。黃酒經(jīng)過多年的發(fā)展，已存在多種類型、傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代工藝并存的格局，因此發(fā)酵周期和酵母生長繁殖存在較大差異，黃酒中的雜醇油含量和生成機(jī)制也各不相同［10］。

本研究建立了一種頂空進(jìn)樣毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定黃酒中雜醇油的含量的方法，通過比較不同類型黃酒中雜醇油含量的差異，探討雜醇油生成機(jī)制和影響因素，對(duì)在生產(chǎn)中控制雜醇油的含量提供建議和思路。

1 材料和方法

1． 1 儀器與試劑

島津 GC2010氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器，DANI HSS86．50頂空進(jìn)樣器;毛細(xì)管色譜柱:PEG－20(25 m ×0．53 mm ×1 μm)，正丙醇、異丁醇、異戊醇均為色譜純(迪馬科技，China)，其余試劑均為市售分析純。黃酒樣品均為超市購買，詳見表1。

1． 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用6%的乙醇溶液分別配成濃度為2．0 g/L的正丙醇、異丁醇和異戊醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存與4℃冰箱待稀釋用。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至50 mL容量瓶中，用6%乙醇溶液定容，配制成正丙醇、異丁醇、異戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為20．0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 黃酒樣品列表

1． 3 氣相色譜分析

1．3．1 氣相色譜測(cè)定條件

柱溫:起始40℃，保持5 min，再以10℃/min升溫至180℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度:200℃;檢測(cè)器溫度:250℃;載氣為氮?dú)猓魉?．5 mL/min(恒流);氫氣:30 mL/min;空氣300 mL/min;尾吹氣28．0 mL/min;頂空:70 ℃保持30 min，分流比1∶1，頂空進(jìn)樣。

1．3．2 回歸方程和線性范圍

移取標(biāo)準(zhǔn)品50mL于容量瓶中，用6%乙醇溶液定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液系列濃度為:20．0、50．0、100．0、200．0、400．0、500．0、1000．0mg/L。在上述色譜條件下依次測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程。

1．3．3 精密度和回收率

取一黃酒樣品于50 mL容量瓶中稀釋定容，在穩(wěn)定的條件下按上述色譜條件測(cè)定其含量，平行實(shí)驗(yàn)5次，計(jì)算平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。在黃酒樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)5次。

1．3．4 黃酒樣品測(cè)定

將各黃酒樣品均稀釋到乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%，50mL容量瓶定容。將標(biāo)準(zhǔn)樣品和各酒樣通過0．45m濾膜過濾，然后分別取4 mL進(jìn)行頂空進(jìn)樣分析，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2． 1 利用保留時(shí)間定性分析

通過外標(biāo)法測(cè)定黃酒中雜醇油的含量，結(jié)果見圖1。各組分按出峰先后順序依次為乙酸乙酯、乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇。在上述色譜分離條件下，按照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定的雜醇油指標(biāo)為正丙醇、異丁醇、異戊醇 3種，其保留時(shí)間分別為 7．563 min，8．779 min和11．111 min，各峰分離效果很好。圖2為黃酒樣品中各組分氣相色譜圖，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)色譜圖可知所要分析的3種高級(jí)醇均得到很好的分離。

圖1 混合標(biāo)樣色譜圖

圖2 黃酒樣品色譜圖

2． 2 定量分析

2．2．1 回歸方程、線性范圍

在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程如表2所示，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線中y為峰面積比(AP/AI)，x為濃度比(CP/CI)。由表2中數(shù)據(jù)可以看出回歸方程相關(guān)系數(shù)均在0．995以上，相關(guān)性較好。

表1 雜醇油各組分的回歸方程、線性范圍

2．2．2 精密度和回收率

取一黃酒樣品50mL容量瓶稀釋定容，在穩(wěn)定的條件下按上述色譜條件測(cè)定其含量，平行實(shí)驗(yàn)5次，計(jì)算平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。如表2所示，RSD 在1．09% ～1．72%，結(jié)果良好。

表2 分析方法的精密度檢驗(yàn)(n=5)

在黃酒樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)5次，結(jié)果如表3所示，本方法加標(biāo)回收率均大于96%。綜合上述實(shí)驗(yàn)，證明所建立的方法準(zhǔn)確可靠。

表3 黃酒樣品加標(biāo)回收率

2． 3 酒樣測(cè)定

按上述方法，對(duì)市場(chǎng)上的10種黃酒中的雜醇油含量進(jìn)行測(cè)定。如表4所示，檢測(cè)的10個(gè)黃酒樣品中，均呈現(xiàn)異戊醇＞異丁醇＞正丙醇，雜醇油的總含量差異明顯。以12%的體積分?jǐn)?shù)計(jì)算，編號(hào)為J的雜醇油含量最低，為152．8mg/L，編號(hào)為A的雜醇油含量最高，為528．4mg/L，是黃酒J的3．45倍。如表4所示，雜醇油含量按黃酒類型，基本呈現(xiàn)出干型＜半干型≈半甜型＜甜型的現(xiàn)象，這說明黃酒工藝對(duì)于其雜醇油含量存在較大的影響。

表4 黃酒樣品雜醇油檢測(cè)結(jié)果

一般認(rèn)為，干型黃酒發(fā)酵醪液較稀，發(fā)酵溫度較低，開耙時(shí)間較短，酵母發(fā)酵繁殖較好，因此雜醇油含量較低。同時(shí)認(rèn)為其酵母生長充分，殘?zhí)禽^低，因此雜醇油可能主要通過糖合成途徑生成。甜型黃酒則剛好相反，發(fā)酵中以酒代水，抑制了酵母菌的生長，發(fā)酵不充分，因此易于生成雜醇油;酒醪中的殘?zhí)橇枯^高，酵母代謝不旺盛，因此雜醇油較難通過糖合成途徑，應(yīng)當(dāng)主要通過Ehlrich途徑生成［11］?？紤]到目前甜型和半甜型仍占據(jù)相當(dāng)大的市場(chǎng)份額，那么抑制Ehlrich途徑是今后工作的方向和重點(diǎn)。

表5 各種酒的雜醇油含量

普遍反映，黃酒飲后舒適度較差，那么是否是雜醇油含量造成的呢?如表5所示，與其他酒相比較，除了清酒之外，其它酒中也呈現(xiàn)異戊醇＞異丁醇＞正丙醇的現(xiàn)象。以單次飲用100 mL酒精量的酒計(jì)算，攝入的雜醇油含量黃酒最高，為292.3 g，是白酒的6.3倍，德國啤酒的3.9倍。雖然也有報(bào)道，飲后所帶來的不適感，不僅與雜醇油相關(guān)，也與酒中酯、醇的含量、組成密切相關(guān)。但是不可忽視的是，雜醇油仍是其中最重要的影響因素之一。

為何黃酒會(huì)產(chǎn)生如此高含量的雜醇油，經(jīng)分析主要是工藝上的差異造成的。黃酒是邊糖化邊發(fā)酵，發(fā)酵醪的濃度較高，酵母生長不旺盛，促進(jìn)了雜醇油的產(chǎn)生。相比較而言，以啤酒為例，啤酒釀造是純種發(fā)酵，酵母量充足，繁殖世代少，同時(shí)糖分消耗迅速，對(duì)氨基酸作用不充分，這在一定程度上均降低了雜醇油的產(chǎn)生。黃酒的主發(fā)酵溫度相對(duì)于啤酒更高也促進(jìn)了雜醇油的生成。因此改善黃酒等是降低雜醇油含量的一個(gè)重要措施，也已有一些工作報(bào)道出現(xiàn)［17］，也可以借鑒其它酒種的發(fā)酵工藝等或通過改造酵母菌種等措施來降低雜醇油含量。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，頂空進(jìn)樣毛細(xì)管氣相色譜法對(duì)黃酒中雜醇油的檢測(cè)，免除了繁雜的樣品前處理過程，具有進(jìn)樣準(zhǔn)確、重復(fù)性好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同來源、類型的10個(gè)酒樣中的雜醇油進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明:黃酒中雜醇油含量在200～500 mg/L之間。所有酒樣的雜醇油分布均表現(xiàn)為異戊醇＞異丁醇＞正丙醇，雜醇油含量在黃酒中的分布呈現(xiàn)出干型＜半干型≈半甜型＜甜型的現(xiàn)象。

本研究結(jié)果比較了不同來源、類型的黃酒的雜醇油的含量，初步分析了生產(chǎn)工藝對(duì)于雜醇油含量的影響，尤其是甜型和半甜型中以酒代水的工藝應(yīng)當(dāng)加以改善，但是深入具體的研究仍有待進(jìn)行。同時(shí)本研究結(jié)果，初步揭示了黃酒中雜醇油含量對(duì)于其品質(zhì)的影響，因此是否將雜醇油這一指標(biāo)引入黃酒標(biāo)準(zhǔn)以適應(yīng)日益提高的食品安全需求也是當(dāng)前亟需考慮的問題。

［1］ Calderbank J，Hammond J R M．Influence of higher alcohol availability on ester formation by yeast［J］．J Am Soc Brew Chem，1994，52(2)，84－90．

［2］ Cisbani B，Muecio A and Travia L．Contents of higher aleohols in wine distillates and grape residue distillates［J］．Rivista della Societa Italianadi Scienza，1977(3):187－189．

［3］ Dickinson，J R，Harrison J，and Hewlins M J．An investigation of the metabolism of valine to isobutyl alcohol in Saccharomyces cerevisiae［J］．J Biol Chem，1998，273:25751－25756．

［4］ 毛青鐘，石彩琴．黃酒中主要上頭物質(zhì)及控制技術(shù)的研究［J］．釀造與發(fā)酵，2010，(3):27－32．

［5］ Lucie A H，Jean－Marc D，Antonius J A van Maris，et al．The Ehrlich Pathway for Fusel Alcohol Production:a Century of Research on Saccharomyces cerevisiae Metabolism［J］．Applied and Environmental Microbiology，2008，74(8):2 259－22 66．

［6］ 毛青鐘．淺談機(jī)械化黃酒中高級(jí)醇含量的控制［J］．釀酒，2000，1:51 －53．

［7］ 殷德榮．毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定紹興黃酒中揮發(fā)性物質(zhì)［J］．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16(8):930－931．

［8］ 郭翔，胡普信，徐巖，等．黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究［J］．釀酒科技，2004(5):79 －81．

［9］ 夏小樂，夏梅芳，楊海麟，等．氣相色譜法測(cè)定清爽型黃酒中的乙醛和雜醇油含量［J］．釀酒，2010，37(6):72－74．

［10］ 陳佩仁，葉春勇，王友崇，等．無蒸煮麥曲黃酒產(chǎn)品的質(zhì)量控制［J］．釀酒科技，2007(12):65－67．

［11］ 劉永樂，俞健，黃壽恩，等．甜型黃酒發(fā)酵過程中的生物和化學(xué)成分性質(zhì)研究［J］．中國食品學(xué)報(bào)，2004，4(1):60－64．

［12］ Dan Y Y，Yukio K，Ronald E S．Higher alcohols，diacetyl，acetoin and 2，3 － butanediol biosynthesis in grapes undergoing carbonic maceration［J］．Food Research International，2006，39:112 －116．

［13］ 王曉茹，王頡．蘋果酒釀造工藝及高級(jí)醇的氣相色譜分析［J］．中國食品學(xué)報(bào)，2006(6):351－356．

［14］ 李春紅，云霞，楊紅．氣相色譜內(nèi)外標(biāo)法分析啤酒中高級(jí)醇含量的比較［J］．中國釀造，2007(4):61－65．

［15］ 傅金泉．日本清酒芳香成分研究概述［J］．釀酒科技，2000(2):83－85．

［16］ 王立釗，梁慧珍，馬樹奎，等．影響固態(tài)發(fā)酵白酒中雜醇油生成因素的研究［J］．釀酒科技，2006(5):43－48．

［20］ 張秋汀，魏桃英．改良型黃酒工藝初探［J］．釀酒科技，2007(1):71－72．